Mänskliga ES-celler: Starta Kultur från frusna celler

Summary

Här kan vi visa hur vårt labb börjar en nyanser stamceller från mänskliga embryon kulturen cellinje från en frusen lager.

Abstract

Här kan vi visa hur vårt labb börjar en nyanser stamceller från mänskliga embryon kulturen cellinje från en frusen lager. För det första är ett till två dygn gamla tio cm tallrik med cirka en (eller två) miljoner bestrålade möss embryonala fibroblast feeder celler sköljas med nyanser media för att avlägsna rester av serum och cellfragment och sedan nyanser media tillkommit och vänster till jämvikt i cellen kultur inkubator. En frusen injektionsflaska med celler från långsiktig flytande kväve lagring eller en-80C frys anskaffas och snabbt nedsänkt i en 37C vattenbad för snabb upptining. Celler i frysning media sedan bort från flaskan och placeras i en stor mängd nyanser medier. Den stora volymen av nyanser medier underlättar borttagning av överskott serum och DMSO, vilket kan orsaka nyanser mänskliga embryonala stamceller att differentiera. Celler är försiktigt spunna ur sin vila, och sedan suspenderas i en liten volym av färska nyanser media som sedan används till utsäde MEF plattan. Det anses viktigt att utsädet MEF plattan genom att försiktigt lägga till nyanser celler i ett droppvis sätt för att jämnt sprida ut dem över hela plattan. Det nybildade nyanser odlingsplatta återförs till inkubator för 48 timmar före media ersätts, matas sedan varje 24 timmar därefter.

Protocol

Tina från en frusen lager: Före upptining nyanser celler, se till att MEF plattan du redan har förberett ordentligt klädd och i gott skick. Försök INTE att använda en mindre än önskvärt platta, eller en som är äldre än tre dagar. Det rekommenderas att i förväg märka alla koniska rör och brunnar som används. Pre-varma nyanser media till 37 ° C. Alikvotera nyanser media i en steril koniska rör fö…

Discussion

I denna video visar vi hur vårt laboratorium rutinmässigt fastställer en nyanser mänskliga embryonala kultur stamcell från ett fruset lager. Denna process är mottaglig för allmänt bruk med alla däggdjursceller om de är frysta i ett DMSO lösning. Effektiv tina är avgörande för att skapa en ny kultur av nyanser celler från en frusen lager, och är viktig för experimentell konsekvens.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 ml Glutamin 6.5 ml NEAA 6.5 ml beta-mercaptoethanol 0.5ul KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 ml bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml