Utilizzando pinzette laser per manipolare i neuroni isolato in vitro
Summary
Questo video descrive la manipolazione di colture di neuroni utilizzando pinzette laser in vitro.
Abstract
In questo articolo e video, si descrive i protocolli utilizzati nel nostro laboratorio per studiare le preferenze di targeting dei processi di rigenerazione delle cellule adulte in vitro i neuroni della retina. Procedure per la preparazione di colture di cellule della retina iniziare con la digestione dissezione, e triturazione della retina, e terminano con la placcatura di isolate cellule della retina sui piatti realizzati appositamente per l'utilizzo con pinzette laser. Questi piatti sono divisi in una metà adesivo cellula e mezzo repellente cellula. Il lato adesivo cella è rivestita con uno strato di Sal-1 anticorpi, che forniscono un substrato su cui le nostre cellule crescono. Altri substrati adesivi potrebbero essere utilizzati per altri tipi di cellule. Il lato repellente cellula è rivestita con un sottile strato di poli-HEMA. Le cellule placcato sulla poli-HEMA lato del piatto sono intrappolati con le pinzette laser, trasportate e poi messo in una cella adiacente sul lato Sal-1 per creare una coppia. Formazione di gruppi di cellule di qualsiasi dimensione dovrebbe essere possibile con questa tecnica. "Laser-pinzette controllato micromanipolazione" significa che il ricercatore può scegliere le celle da spostare, e la distanza desiderata tra le cellule possono essere standardizzati. Poiché il raggio laser passa attraverso superfici trasparenti del piatto cultura, la selezione delle cellule e il posizionamento sono fatte in ambiente chiuso ambiente sterile. Le cellule possono essere monitorati tramite video time-lapse e utilizzato con qualsiasi tecnica cellula biologica richiesti. Questa tecnica può aiutare indagini di interazioni cellula-cellula.
Protocol
Discussion
La luce ha slancio, e quando un raggio di luce viene rifratta che passa attraverso una cella, è necessaria una forza per cambiare la direzione del momento. A causa della legge di conservazione del momento, una forza nella direzione opposta deve, a sua volta, reagisce di nuovo su una cella. Ashkin (1991) ha mostrato che la forza generata da un fascio laser focalizzato da una lente obiettivo microscopio si muoverà una cella verso il centro della messa a fuoco. Anche se un raggio laser genera solo un paio di piconewtons di forza, questa forz…
Acknowledgements
La ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH EY012031 e EY0182175 e la FM Kirby Foundation.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR Scientific Inc., Westchester, PA | 48380 080 | ||
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Chemical Co., St Louis, MO | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol | |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International, Temecula CA | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use | |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | ||
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning Inc., Corning NY | 7078A-5 | ||
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning inc., Corning NY | 430165 | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning Corp., Midland MI | |||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | |||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | Numerical aperture (N.A. 1.3) | ||
| Black and white CCD camera | Sony Corporation, Tokyo, Japan | |||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
Riferimenti
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
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- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
