Använda Laser pincett för att manipulera enstaka nervceller i Vitro
Summary
Denna video beskriver manipulation av odlade nervceller med hjälp av laser pincett in vitro.
Abstract
I detta papper och video beskriver vi de protokoll som används i vårt laboratorium för att studera inriktningen preferenser förnya cellprocesser av vuxna näthinnans nervceller in vitro. Rutiner för beredning av retinal cellkulturer börja med dissektion, matsmältningen och trituration av näthinnan och avsluta med plätering av isolerade näthinnans celler på rätter gjorda speciellt för användning med laser pincett. Dessa rätter är uppdelad i en cell lim halv och en cell avskräckningsmedel halv. Cellen självhäftande sidan är belagd med ett lager av Sal-1-antikroppar, som ger ett underlag på vilken våra celler växa. Andra lim substrat kan användas för andra celltyper. Cellen avskräckningsmedel sidan är belagd med ett tunt lager av poly-HEMA. Cellerna pläterade på poly-HEMA sidan av skålen sitter fast med laser pincett, transporteras och sedan placeras i anslutning till en cell i Sal-1 sida för att skapa ett par. Bildandet av celler grupper av alla storlekar bör vara möjligt med denna teknik. "Laser-pincett-kontrollerad mikromanipulation" innebär att utredaren kan välja vilka celler att röra sig, och önskat avstånd mellan cellerna kan standardiseras. Eftersom laserstrålen går genom öppna ytor av kulturen skålen, är cellen Urvalet och placeringen sker i en sluten, steril miljö. Cellerna kan övervakas av video tidsförlopp och användas med någon cell nödvändiga biologiska teknik. Denna teknik kan hjälpa undersökningar av cell-cell interaktioner.
Protocol
Discussion
Ljus har fart, och när en ljusstråle bryts när den passerar genom en cell, är en kraft som krävs för att ändra riktningen på den drivkraft. På grund av lagen om bevarande av rörelsemängd, måste en kraft i motsatt riktning i sin tur reagerar tillbaka på en cell. Ashkin (1991) visade att den kraft som genereras av en laserstråle fokuserad genom ett mikroskop objektiv kommer att flytta en cell mot mitten av fokus. Även om en laserstråle genererar bara några piconewtons i kraft, är denna kraft tillräckligt för att dra en cel…
Acknowledgements
Forskningen stöds av NIH Bidrag EY012031 och EY0182175 och FM Kirby Foundation.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR Scientific Inc., Westchester, PA | 48380 080 | ||
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Chemical Co., St Louis, MO | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol | |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International, Temecula CA | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use | |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | ||
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning Inc., Corning NY | 7078A-5 | ||
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning inc., Corning NY | 430165 | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning Corp., Midland MI | |||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | |||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | Numerical aperture (N.A. 1.3) | ||
| Black and white CCD camera | Sony Corporation, Tokyo, Japan | |||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
Riferimenti
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
- MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
- MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
- Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
- Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
