In Vitro İzole Nöronlar kurgulama için Lazer Cımbız
Summary
Bu video in vitro lazer cımbız kullanarak manipülasyon kültürlü nöronların açıklamaktadır.
Abstract
Bu kağıt ve video, hedefleme tercihleri, in vitro yetişkin retinal nöronların yenileyici hücre süreçlerini incelemek için laboratuarda kullanılan protokoller açıklanmaktadır. Kaplama ile izole retina hücrelerinin özellikle lazer cımbız ile kullanımı için yapılan yemekler diseksiyonu, sindirim ve retina, öğütme ve bitiş retinal hücre kültürlerinin hazırlanması için prosedürler ile başlar. Bu yemekleri bir hücre yapışkan yarım ve bir hücre itici yarısı ayrılır. Hücre yapıştırıcı yan hücrelerin büyümesine üzerine bir substrat sağlarlar Sal-1 antikorları, bir tabaka ile kaplanmıştır. Diğer yapışkan substratlar diğer hücre türleri için kullanılabilir. Hücre itici tarafı poli-HEMA ince bir tabaka ile kaplıdır. Yemeğin poli-HEMA tarafında kaplama hücreleri, lazer cımbız ile tuzağa taşınan ve ardından bir çift oluşturmak için bir hücre Sal-1 tarafta komşu olarak yerleştirilmelidir. Bu teknik ile herhangi bir boyut hücre gruplarının oluşumu mümkün olmalıdır. "Lazer cımbız kontrollü mikromanipülasyon" araştırmacı hücreleri taşımak için hangi seçim anlamına gelir, ve hücreler arasındaki istenen mesafe standart olabilir. Çünkü lazer ışını kültür çanağı şeffaf yüzeylerden geçer, hücre seçme ve yerleştirme, kapalı, steril bir ortamda yapılır. Hücreler video time-lapse tarafından izlenmekte ve gerekli her türlü hücre biyolojik tekniği ile kullanılabilir. Bu teknik, hücre-hücre etkileşimleri soruşturma yardımcı olabilir.
Protocol
Discussion
Işık momentumu vardır ve bir hücre geçerken kırılan bir ışık ışını zaman, bir kuvvet momentum yönünü değiştirmek için gerekli. Çünkü momentumun korunumu yasası, ters yönde bir kuvvet, sırayla, bir hücre tepki vermelidir. Ashkin (1991) mikroskop objektif lens ile odaklanmış bir lazer ışını tarafından üretilen kuvvet, bir hücre odak merkezine doğru hareket edeceğini gösterdi. Bir lazer ışını sadece birkaç piconewtons güç üretir rağmen, bu gücün, orta aracılığıyla bir hücre çekmek için y…
Acknowledgements
Araştırma NIH Grants EY012031 ve EY0182175 ve FM Kirby Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR Scientific Inc., Westchester, PA | 48380 080 | ||
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Chemical Co., St Louis, MO | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol | |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International, Temecula CA | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use | |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | ||
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning Inc., Corning NY | 7078A-5 | ||
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning inc., Corning NY | 430165 | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning Corp., Midland MI | |||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | |||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | Numerical aperture (N.A. 1.3) | ||
| Black and white CCD camera | Sony Corporation, Tokyo, Japan | |||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
Riferimenti
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
- MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
- MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
- Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
- Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
