Utilizando pinzas láser para manipular neuronas aisladas in vitro
Summary
Este video describe la manipulación de cultivos de neuronas con pinzas láser in vitro.
Abstract
En este documento y de vídeo, se describen los protocolos utilizados en nuestro laboratorio para estudiar las preferencias de orientación de los procesos de regeneración celular de neuronas de la retina adulta in vitro. Procedimientos para la preparación de los cultivos de células retinianas comienzan con la disección, la digestión y la trituración de la retina, y terminar con el revestimiento de células aisladas de la retina en platos elaborados especialmente para su uso con pinzas láser. Estos platos se dividen en un medio adhesivo celular y una media de células repelente. El lado adhesivo celular está recubierta con una capa de Sal-1 anticuerpos, que proporcionan un sustrato sobre el que las células crecen. Otros sustratos adhesivos podrían ser utilizados para otros tipos de células. El lado repelente de la célula está recubierta con una fina capa de poli-HEMA. Las células plateado en la parte de poli-HEMA del plato son atrapados con las pinzas láser, transportados y luego se coloca junto a una celda de la Sal-1 lado para crear un par. Formación de grupos de células de cualquier tamaño, debería ser posible con esta técnica. "Pinzas láser controlado por micromanipulación" significa que el investigador puede elegir la que las células se muevan, y la distancia deseada entre las células pueden ser estandarizados. Debido a que el rayo láser pasa a través de superficies transparentes de la placa de cultivo, selección y colocación de células se llevan a cabo en un ambiente cerrado y estéril. Las células pueden ser monitoreados por video time-lapse y utilizar en cualquier técnica de las células biológicas requeridas. Esta técnica puede ayudar a las investigaciones de las interacciones célula-célula.
Protocol
Discussion
La luz tiene un momento, y cuando un rayo de luz se refracta al pasar a través de un celular, se requiere una fuerza para cambiar la dirección del momento. Debido a la ley de conservación del momento, una fuerza en la dirección opuesta que, a su vez, reacciona de nuevo en una celda. Ashkin (1991) demostró que la fuerza generada por un rayo láser enfocado por una lente objetivo del microscopio se mueve una celda hacia el centro de atención. A pesar de que un rayo láser genera sólo un piconewtons pocos de la fuerza, esta fuerza es su…
Acknowledgements
La investigación fue apoyada por subvenciones del NIH EY012031 y EY0182175 y la Fundación FM Kirby.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR Scientific Inc., Westchester, PA | 48380 080 | ||
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Chemical Co., St Louis, MO | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol | |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International, Temecula CA | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use | |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | ||
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning Inc., Corning NY | 7078A-5 | ||
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning inc., Corning NY | 430165 | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning Corp., Midland MI | |||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | |||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | Numerical aperture (N.A. 1.3) | ||
| Black and white CCD camera | Sony Corporation, Tokyo, Japan | |||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
Riferimenti
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
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- MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
- Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
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- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
