Methylated DNA의 Immunoprecipitation
Summary
이 동영상은 methylated DNA의 immunoprecipitation (MeDIP)에 대한 프로토콜을 보여줍니다. MeDIP가 선택 (안티 – 5 MC) 5 methylcytosine에 대한 특이성과 항체를 사용하여 게놈 DNA 샘플에서 methylated DNA 조각을 추출 두 하루 절차입니다.
Abstract
DNA의 methylation 패턴의 식별은 methylation은 유전자 발현에 큰 영향을 미칠 것으로 알려져으로 epigenetics의 연구에서 일반적인 절차이며, 정상적인 발달뿐만 아니라 질병에 관여<sup> 1-4</sup>. 그러므로, methylated DNA가 아닌 methylated DNA 구별하는 능력은 연구 methylation 프로파일을 생성하기 위해 필수적입니다. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP)는 관심의 샘플에서 methylated DNA의 추출을위한 효율적인 기술입니다<sup> 5-7</sup>. DNA의 짧은 200 NG의 예제는 항체 또는 immunoprecipitation (IP), 반응 충분합니다. DNA는 300-1000 BP의 크기에 이르기까지 조각으로 sonicated이며, immunoprecipitated (IP)과 입력 (IN) 부분으로 나뉘어져 있습니다. IP DNA는 이후 단클론 항체가 methylated DNA를 바인딩 수 있도록, 변성 그리고 안티 5'mC와 incubated 열 수 있습니다. 이 후, 차 항체에 대한 친화력이있는 이차 항체를 포함하는 자성 비즈를 추가하고, incubated 있습니다. 이러한 비드 링크된 항체는 첫 번째 단계에서 사용하는 단클론 항체를 바인딩합니다. 항체 복합 (methylated DNA)에 바운드 DNA는 솔루션의 단지를 빼내 자석을 사용하여 DNA의 나머지 부분에서 분리됩니다. IP 버퍼를 사용하는 몇 가지 세척은 다음 언바운드 아닌 methylated DNA를 제거하기 위해 수행됩니다. methylated DNA / 항체 단지 그 다음은 methylated DNA가 그대로 둔 항체를 소화 Proteinase K와 소화하고 있습니다. 단백질 물질을 제거하는 클로로포름 추출 후 나중에 사용하기 위해 시켰던과 물에 resuspended : 농축 DNA는 페놀로 정화됩니다. PCR 기법은 IP의 증폭 제품을 분석하여하고 부족으로 알려진 methylated 시퀀스를 포함하는 것으로 알려진 지역에 대한 DNA에 MeDIP 절차의 효율성을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 정화 methylated DNA는 다음 로커스 특정 (PCR) 또는 게놈 전체 (microarray 및 시퀀싱) methylation 연구에 사용하고, 같은 유전자 발현 프로 파일링 및 배열 비교 게놈 하이브 리다이 제이션 등 다른 연구 도구와 함께 적용하면 (특히 유용합니다 수 있습니다 CGH)<sup> 8</sup>. DNA의 methylation에 추가 수사를 차례로, aberrantly methylated DNA의 특징과 같은 암 같은 질병에 대한 새로운 치료 또는 전조의 연구 도구를 개발에 유용할 수 있습니다 새로운 epigenetic 목표의 발견으로 이어질 것입니다<sup> 2, 4, 9-11</sup>.
Protocol
Discussion
질병에있는 중요한 역할의 DNA methylation의 재생의 성장 의식이있다,이 수정을 측정 assays의 따라서 개발은 13 초, 12 초, 3 점차 중요 해지고 있습니다. MeDIP 기술은 전체 게놈과 로커스 – 특정 레벨 6, 7 모두에서 검사를받을 수있는 도구입니다. 이 기술은 DNA를 시작하는 제한된 양의를 사용하여 DNA의 methylation 수준의 빠른 볼을 제공하며 서로 다른 소스 사이에서 쉽게 비교를 위해 수 있…
Acknowledgements
우리는이 비디오 및 문서를 비평에 참여를 위해 갈색과 램 실험실의 구성원을 감사하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구와 건강 연구에 대한 마이클 스미스 재단에 대한 캐나다 연구소에서 자금을 지원했다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Biorupter sonicator | Tool | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Altro | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 Spectrophotometer | Tool | NanoDrop | ||
| Primary Antibody: Anti-5′-methylcytosine mouse mAb | Reagent | CalBiochem | 162 33 D3 | |
| Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagent | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetic Tube Rack | Tool | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Tool | Labnet International | H5500 | |
| IP Buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature | |||
| Digestion Buffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
Riferimenti
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