Methylierte DNA Immunpräzipitation

Summary

Dieses Video zeigt das Protokoll für die methylierte DNA Immunpräzipitation (MeDIP). MeDIP ist eine zweitägige Verfahren, die selektiv extrahiert methylierte DNA-Fragmente aus einer genomischen DNA-Probe unter Verwendung von Antikörpern mit Spezifität für 5-Methylcytosin (anti-5 mC).

Abstract

Die Identifizierung von DNA-Methylierungs-Muster ist ein übliches Verfahren in der Studie der Epigenetik, wie Methylierung ist bekannt, dass mit erheblichen Auswirkungen auf die Genexpression haben, und ist mit der normalen Entwicklung sowie Krankheit beteiligt^1-4. So ist die Fähigkeit, zwischen methylierter DNA und nicht methylierter DNA zu unterscheiden wesentlichen für die Erzeugung Methylierung Profile für solche Studien. Methylierte DNA Immunpräzipitation (MeDIP) ist eine hocheffiziente Technik zur Gewinnung von methylierter DNA aus einer Probe von Interesse^5-7. Eine Probe von weniger als 200 ng der DNA ist ausreichend für den Antikörper oder Immunpräzipitation (IP), Reaktion. DNA in Fragmente mit einer Größe von 300-1000 bp beschallt, und ist in immunpräzipitiert (IP) und Eingang (IN) Abschnitte unterteilt. IP DNA wird anschließend Hitze denaturiert und dann mit anti-5'mC inkubiert, so dass der monoklonale Antikörper an methylierte DNA binden. Danach werden magnetische Kügelchen mit einem sekundären Antikörper mit einer Affinität für den primären Antikörper zugegeben und inkubiert. Diese Wulst-linked Antikörper binden die monoklonalen Antikörper in der ersten Stufe eingesetzt. DNA gebunden an die Antikörper-Komplex (methylierte DNA) wird aus dem Rest der DNA mit Hilfe eines Magneten, um die Komplexe zu ziehen aus der Lösung getrennt. Mehrmaligem Waschen mit IP-Puffer werden dann durchgeführt, um die ungebundenen, nicht-methylierte DNA zu entfernen. Das methylierte DNA / Antikörper-Komplexe werden dann mit Proteinase K verdaut, um die Antikörper so dass nur die methylierte DNA intakt zu verdauen. Die angereicherte DNA wird durch Phenol gereinigt: Chloroform-Extraktion an das Protein Stoffe zu entfernen und dann gefällt und in Wasser resuspendiert für die spätere Verwendung. PCR-Techniken können verwendet werden, um die Effizienz der MeDIP Verfahren durch eine Analyse der Amplifikationsprodukte von IP und IN DNA für Regionen bekannt, Mangel und bekannte methylierte Sequenzen enthalten validieren. Das gereinigte methylierte DNA kann dann für Locus-spezifischen (PCR) oder genomweite (Microarray-und Sequenzierung) Methylierung Studien verwendet werden, und ist besonders nützlich, wenn sie in Verbindung mit anderen Forschungs-Tools wie Genexpressions-Profiling-und Array-vergleichende Genom-Hybridisierung angewendet ( CGH)⁸. Weitere Untersuchungen in der DNA-Methylierung wird die Entdeckung von neuen epigenetischen Zielen, was wiederum nützlich sein bei der Entwicklung von neuen therapeutischen oder prognostischen Forschungsinstrumente für Krankheiten wie Krebs, die von methylierter DNA charakterisiert werden kann dazu führen,^{2, 4, 9-11}.

Protocol

DNA-Extraktion und Probenvorbereitung DNA aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Proben (kultivierten Zellen, Frischplasma sowie Formalin-fixierten Paraffin eingebetteten Gewebe) kann für MeDIP verwendet werden. Es ist wichtig, hochreine DNA ohne assoziierte Proteine ​​wie Histone verwenden. Es ist auch wichtig, so viel wie möglich zu entfernen RNA aus der Probe, wie es mit den beiden DNA-Quantifizierung und Antikörperbindung stören können. Die DNA-Menge für MeDIP verwendet werden …

Discussion

Es gibt ein wachsendes Bewusstsein für die wichtige Rolle der DNA-Methylierung spielt in Krankheit, sind daher die Entwicklung von Assays, um diese Änderung zu messen zunehmend an Bedeutung ^{3, 12, 13.} Die MeDIP Technik ist ein Werkzeug für das Screening zugänglich sowohl den gesamten Genoms und Locus-spezifische Level ^{6, 7.} Diese Technik bietet eine schnelle Ansicht von DNA-Methylierungs-Ebenen mit begrenzten Mengen an Ausgangs-DNA und ermöglicht eine einfache Vergleiche zwischen verschiedenen…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Biorupter sonicator	Tool	Diagenode	UCD-200 TM
1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes	Altro	Sorenson BioScience	11510
ND 3300 Spectrophotometer	Tool	NanoDrop
Primary Antibody: Anti-5′-methylcytosine mouse mAb	Reagent	CalBiochem	162 33 D3
Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG	Reagent	Invitrogen	112-01D
Magnetic Tube Rack	Tool	Invitrogen	CS15000
Mini LabRoller	Tool	Labnet International	H5500
IP Buffer				10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature
Digestion Buffer				10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl