Questo video dimostra tutta montare immunoistochimica, un metodo con cui il modello di espressione spaziale e temporale di un antigene può essere visualizzata in embrioni di pollo giovani. Questo metodo è stato originariamente introdotto da Jane e Tom Dodd Jessell.
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Articolo metodologico
Metodo per la colorazione intero anticorpi Monte a Chick
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'embrione di pollo è uno strumento prezioso per lo studio dello sviluppo embrionale precoce. La sua trasparenza, accessibilità e facilità di manipolazione, lo rendono uno strumento ideale per studiare l'espressione di anticorpi nello sviluppo del cervello, del tubo neurale e somite. Questo video mostra le diverse fasi, in tutto il montaggio colorazione anticorpale utilizzando anticorpi coniugati con HRP secondaria; In primo luogo, l'embrione è sezionato dall'uovo e fissati in paraformaldeide. In secondo luogo, perossidasi endogena è inattivato; L'embrione viene quindi esposto a anticorpo primario. Dopo numerosi lavaggi, l'embrione viene incubato con l'anticorpo secondario coniugato con HRP. Perossidasi viene rivelato tramite la reazione con il substrato diaminobenzidina. Infine, l'embrione è fisso ed elaborati per la fotografia e sezionamento. Il vantaggio di questo metodo rispetto all'uso di anticorpi fluorescenti è che gli embrioni possono essere trattati per sezionamento cera, permettendo così lo studio dei siti antigene nella sezione trasversale. Questo metodo è stato originariamente introdotto da Jane e Tom Dodd Jessell
Protocollo
I. Panoramica schematica:
Questo video mostra le diverse fasi in immunoistochimica montare tutto in embrione di pollo. In primo luogo, l'embrione è fissato in PFA [IHC1]. Poi, l'attività della perossidasi endogena si spegne [IHC2]. L'embrione viene quindi incubato in anticorpo primario [IHC3]. Dopo numerosi lavaggi, l'embrione viene incubato in anticorpo secondario [IHC4]; reazione del colore è rivelato utilizzando DAB [IHC5] e colorazione anticorpale sembra arancione [IHC6].
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Discussione
Questo video mostra le varie fasi di esecuzione di tutto il montaggio colorazione anticorpi in embrioni di pollo giovani. Questo protocollo è essenzialmente utilizzato per la caratterizzazione spaziale e temporale di anticorpi romanzo in pulcino 2,3, così come per l'uso di marcatori antigenica nota per determinare malformazioni embrionali seguenti insulto 4.
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Ringraziamenti
Gli anticorpi monoclonali (15.3B9, PAX7) sviluppato da (J. Dodd, TM Jessell e A. Kawakami) sono stati ottenuti dalla Banca dello Sviluppo Studi Ibridoma sviluppato sotto l'egida del NICHD e mantenuto dalla University of Iowa, Dipartimento di Scienze biologiche , Iowa. DP è destinatario del Premio Ruth Kirschstein DA021977 1F32-01A1 dal National Institute on Drug Abuse. Questo lavoro è stato sostenuto dal M. Margaret Alkek Fondazione RHF.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Uova | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fecondate, HH4 (16 ore) | |
| Stereomicroscopio | Microscopio | Leica Microsystems | MZ9.5 o simile | |
| Incubatrice Automatica Marsh | Altro | Lyon | RX | |
| Pinzette curve (1) | Strumento | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Pinzette (2) | Strumento | Fine Science Tools | 11002-13 | |
| Forbici fini | Strumento | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Piatti di plastica | Strumento | Falcon BD | 353001 | |
| Pompetta di gomma | Strumento | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pipetta capillare Pasteur | Strumento | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | Estremità arrotondata alla fiamma |
| Lama per microdissezione | Strumento | Fine Science Tools | 10056-12 | Utilizzare per tagliare l'embrione dalle membrane circostanti dopo la fissazione |
| Agente indurente e base di elastomero siliconico Sylgard 184 | Reagente | Dow Corning | 0001986475 | Mescolare 1 parte di agente indurente con 9 parti di base; lasciare a riposo tutta la notte a 37°C |
| PFA al 16% | Reagente | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| H2O2 al 30% | Reagente | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| BSA | Reagente | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| NGS | Reagente | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Anticorpi primari | Reagente | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4G11, 15.3B9, PAX7 | Per questi anticorpi, gli sperimentatori hanno utilizzato donatori di topo |
| Immunoglobulina G di capra anti-topo coniugata con perossidasi (H+L) | Reagente | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| 3,3’-diamminobenzidina tetracloridrato | Reagente | Pierce, Thermo Scientific | 34001 | Conservare a -20°C; lasciare che il flacone raggiunga la temperatura ambiente prima dell'uso. |
| Olio di legno di cedro | Reagente | Sigma-Aldrich | W522503 | |
| Fast green FCF | Reagente | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Puntine minutene, diametro 0,2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 |
Riferimenti
- Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
- Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E.
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Ristampe e permessi
