Qui vi presentiamo un metodo per isolare e cultura dei granuli cerebellari cellule progenitrici dei neuroni e neuroni granuli cerebellari da mouse postnatale.
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Articolo metodologico
Isolamento e la coltura di cellule post-Natal Neuron cerebellare granuli mouse progenitore e Neuroni
In questo articolo
Sommario
Abstract
La corteccia cerebellare è una struttura ben descritto che offre opportunità uniche per studiare le proprietà neuronali e 1,2 di sviluppo. Dei tipi neuronali del cervelletto (cellule dei granuli, cellule di Purkinje e interneuroni inibitori), i neuroni dei granuli sono di gran lunga i più numerosi e sono il tipo più abbondante di neuroni nel cervello dei mammiferi. Nei roditori, i neuroni granuli cerebellari sono generati durante i primi due post-natale settimane da cellule progenitrici nello strato più esterno della corteccia cerebellare, lo strato granulare esterno (EGL). Il protocollo presentato qui descrive le tecniche per arricchire e neuroni dei granuli cultura e le loro cellule progenitrici dal post-natale del cervelletto mouse. Si descrivono le procedure per ottenere colture di purezza crescente 3,4, che può essere utilizzato per studiare la differenziazione delle cellule progenitrici proliferano in neuroni dei granuli 5,6. Una volta che le cellule progenitrici differenziare, le culture forniscono anche una popolazione omogenea di neuroni granulari per la manipolazione sperimentale e caratterizzazione di fenomeni come la sinaptogenesi, la funzione dei recettori del glutammato 7, l'interazione con altre cellule purificate cerebellari 8,9 o morte cellulare 7.
Protocollo
Parte 1: Impostazione (1-2 giorni prima della dissezione) (Non mostrato in video)
- PREPARAZIONE SOLUZIONI CULTURA E MEDIA:
- 4X CMF-PBS-EDTA (calcio e magnesio libero-tampone fosfato-EDTA per diluizioni Percoll): litro, aggiungere 32 g di NaCl, 1,2 g di KCl, 8 g di glucosio, 2 g di NaH 2 PO 4, 1 g di KH 2 PO 4, 8 ml al 2% NaHCO stock 3, 10 ml EDTA 1M (pH 8,0) a distillata / deionizzata. Regolare il volume di 1 litro e il pH a 7,4. Filtro sterilizzare.
- HBSS-GLUCOSIO: Aggiungi glucosio (6 grammi / litro) al calcio e magnesio Salt libero di Hank Soluzione Balance (HBSS) e filtro sterile. 50....
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Discussione
Questo protocollo si basa su modificazioni delle procedure che sono state descritte in passato 3,7,11. Ci sono diversi punti importanti da notare come descritto di seguito.
I neuroni e le cellule progenitrici dei granuli aderire entro 2 ore dalla placcatura. Le cellule sane hanno una morfologia rotonda sotto il contrasto di fase 4 microscopio. Entro 24 ore dopo la placcatura, le cellule sane si diffonderà in modo uniforme in tutto il coprioggetto o il pozzo di plastica e formeranno processi. Al momento del camb.......
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Ringraziamenti
Ringraziamo Barbara Carletti e Anna Marie Kenney per i preziosi suggerimenti. HYL è sostenuta dalla borsa di formazione "Gli ormoni: Biochimica e Biologia Molecolare", DK07328. Sostenuto in parte dal NIH concedere 5R01 NS16951 (CAM).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Filtro cellulare con pori da 70μm | BD Biosciences | 352350 | |
| Ago spinale | BD Biosciences | 405182 | 20G x 3-1/2 pollici |
| Poli-D-lisina, peso molecolare>300.000 | Sigma-Aldrich | P1024 | Ogni nuovo lotto di poli-D-lisina deve essere testato. |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P-1644 | |
| Penicillina-Streptomicina (100X) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-103 | Deve essere privo di calcio e magnesio. |
| Mezzo Neurobasal A | Invitrogen | 10888-022 | |
| Supplemento Glutamax I | Invitrogen | 35050-061 | |
| Supplemento privo di siero B-27 (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Coverslip circolari da 12 mm | Carolina Biological | 63-3029 | Questi sono prodotti in Germania da Deckglaser. |
| Coverslip circolari da 25 mm | Carolina Biological | 63-3037 | Questi sono prodotti in Germania da Deckglaser. |
| Sistema di dissociazione con papaina | Worthington Biochemical | LK 003150 | Il kit è sufficiente per cinque isolamenti. |
| Forbici Permaset | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6782 | |
| Dumont n. 5 (Dumostar) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4978 | |
| Piatto coltura da 4 pozzetti | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Piatto coltura da 6 pozzetti | Nalge Nunc international | 140685 |
Riferimenti
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. Boca Raton. (1997).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).
- Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E. in Culturing Nerve Cells<....
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Ristampe e permessi
