Isolamento e la coltura di cellule post-Natal Neuron cerebellare granuli mouse progenitore e Neuroni
Summary
Qui vi presentiamo un metodo per isolare e cultura dei granuli cerebellari cellule progenitrici dei neuroni e neuroni granuli cerebellari da mouse postnatale.
Abstract
La corteccia cerebellare è una struttura ben descritto che offre opportunità uniche per studiare le proprietà neuronali e 1,2 di sviluppo. Dei tipi neuronali del cervelletto (cellule dei granuli, cellule di Purkinje e interneuroni inibitori), i neuroni dei granuli sono di gran lunga i più numerosi e sono il tipo più abbondante di neuroni nel cervello dei mammiferi. Nei roditori, i neuroni granuli cerebellari sono generati durante i primi due post-natale settimane da cellule progenitrici nello strato più esterno della corteccia cerebellare, lo strato granulare esterno (EGL). Il protocollo presentato qui descrive le tecniche per arricchire e neuroni dei granuli cultura e le loro cellule progenitrici dal post-natale del cervelletto mouse. Si descrivono le procedure per ottenere colture di purezza crescente 3,4, che può essere utilizzato per studiare la differenziazione delle cellule progenitrici proliferano in neuroni dei granuli 5,6. Una volta che le cellule progenitrici differenziare, le culture forniscono anche una popolazione omogenea di neuroni granulari per la manipolazione sperimentale e caratterizzazione di fenomeni come la sinaptogenesi, la funzione dei recettori del glutammato 7, l'interazione con altre cellule purificate cerebellari 8,9 o morte cellulare 7.
Protocol
Discussion
Questo protocollo si basa su modificazioni delle procedure che sono state descritte in passato 3,7,11. Ci sono diversi punti importanti da notare come descritto di seguito.
I neuroni e le cellule progenitrici dei granuli aderire entro 2 ore dalla placcatura. Le cellule sane hanno una morfologia rotonda sotto il contrasto di fase 4 microscopio. Entro 24 ore dopo la placcatura, le cellule sane si diffonderà in modo uniforme in tutto il coprioggetto o il pozzo di plastica e formeranno processi. Al momento del cam…
Acknowledgements
Ringraziamo Barbara Carletti e Anna Marie Kenney per i preziosi suggerimenti. HYL è sostenuta dalla borsa di formazione "Gli ormoni: Biochimica e Biologia Molecolare", DK07328. Sostenuto in parte dal NIH concedere 5R01 NS16951 (CAM).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell strainer with 70μm mesh pore | BD Biosciences | 352350 | ||
| Spinal Needle | BD | 405182 | 20G x 3-1/2 inches | |
| Poly-D-Lysine mol wt>300,000 | Sigma | P1024 | Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested. | |
| Percoll | Sigma | P-1644 | ||
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Sigma | P4333 | ||
| HBSS | Invitrogen | 14175-103 | Must be calcium and magnesium free. | |
| Neurobasal A-Medium | Invitrogen | 10888-022 | ||
| Glutamax I supplement | Invitrogen | 35050-061 | ||
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | ||
| 12-mm circle coverslips | Carolina Biological Supply | 63-3029 | These are made in Germany by Deckgluder. | |
| 25-mm circle coverslips | Carolina Biological Supply | 63-3037 | These are made in Germany by Deckgluder. | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK 003150 | Kit is good for five isolations. | |
| Permaset scissors | Roboz | RS6782 | ||
| Dumont #5 (Dumostar) | Roboz | RS4978 | ||
| 4-well culture dish | Nunc | 176740 | ||
| 6-well culture dish | Nunc | 140685 |
Riferimenti
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