ポストナタールマウス小脳顆粒ニューロン前駆細胞と神経細胞の単離と培養
Summary
ここでは、出生後のマウスから小脳顆粒ニューロン前駆細胞や小脳顆粒ニューロンを分離して培養する方法を提示する。
Abstract
小脳皮質は神経細胞の特性と開発の1,2を研究するためのユニークな機会を提供するだけでなく説明する構造です。小脳ニューロンタイプ（顆粒細胞、プルキンエ細胞と抑制性介在）のうち、顆粒ニューロンは、これまでで最も多数あり、哺乳類の脳における神経細胞の中で最も豊富なタイプです。げっ歯類では、小脳顆粒ニューロンは小脳皮質、外顆粒層（EGL）の最外層の前駆細胞からの最初の二つの出生後の数週間の間に生成されます。ここで紹介するプロトコールは、豊かにする技術と文化の顆粒ニューロンと出生後のマウスの小脳からそれらの前駆細胞を説明します。我々は、顆粒ニューロン5,6に前駆細胞の増殖分化を研究するために使用することができます増やす純度3,4の文化を、取得する手順を説明します。一度前駆細胞が分化、文化はまた、シナプス形成、グルタミン酸受容体の機能7、他の精製された小脳細胞8,9または細胞死7との相互作用などの現象の実験的操作と特性評価のための顆粒神経細胞の均質な集団を提供しています。
Protocol
パート1：（ビデオで示されていません）（解剖前に1〜2日）の設定培養液とメディアを準備： 4X CMF – PBS – EDTA（パーコールの希釈のためのカルシウムとマグネシウムのフリーリン酸緩衝生理食塩水- EDTA）：リットルは、32グラムのNaCl、1.2グラムのKCl、8 gのグルコース、2グラムのNaH 2 PO 4、1gのKH 2 POを追加する4、8 mLの2％のNaHCO 3の株式、脱?…
Discussion
このプロトコルは、過去3,7,11に記載されている手順の変更に基づいています。以下に述べるように注意することは、いくつかの重要な点があります。
顆粒ニューロンおよび前駆細胞は、メッキの2時間以内に従っている。健康な細胞は位相差顕微鏡の4の下にある丸い形態を持っている。メッキ後24時間以内に、健康な細胞はカバースリップまたはプラスチック製のよく周りに均等に広が…
Acknowledgements
我々は、貴重な提案をバーバラカルレッティとアンナマリーケニーに感謝します。 、DK07328：HYLはトレーニンググラント"生化学分子生物学ホルモン"によってサポートされています。 NIHの助成金5R01 NS16951（CAM）によって部分的にサポート。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell strainer with 70μm mesh pore | BD Biosciences | 352350 | ||
| Spinal Needle | BD | 405182 | 20G x 3-1/2 inches | |
| Poly-D-Lysine mol wt>300,000 | Sigma | P1024 | Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested. | |
| Percoll | Sigma | P-1644 | ||
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Sigma | P4333 | ||
| HBSS | Invitrogen | 14175-103 | Must be calcium and magnesium free. | |
| Neurobasal A-Medium | Invitrogen | 10888-022 | ||
| Glutamax I supplement | Invitrogen | 35050-061 | ||
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | ||
| 12-mm circle coverslips | Carolina Biological Supply | 63-3029 | These are made in Germany by Deckgluder. | |
| 25-mm circle coverslips | Carolina Biological Supply | 63-3037 | These are made in Germany by Deckgluder. | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK 003150 | Kit is good for five isolations. | |
| Permaset scissors | Roboz | RS6782 | ||
| Dumont #5 (Dumostar) | Roboz | RS4978 | ||
| 4-well culture dish | Nunc | 176740 | ||
| 6-well culture dish | Nunc | 140685 |
Riferimenti
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IsolationCulturePost-natalMouse CerebellarGranule Neuron Progenitor CellsNeuronsCerebellar CortexNeuronal PropertiesDevelopmentGranule NeuronsPurkinje CellsInhibitory InterneuronsMammalian BrainRodentsExternal Granule Layer (EGL)EnrichmentPurityDifferentiationProliferating Progenitor CellsSynaptogenesisGlutamate Receptor FunctionInteraction With Other Purified Cerebellar CellsCell Death
Citazione di questo articolo
Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons . J. Vis. Exp. (23), e990, doi:10.3791/990 (2009).