Isolamento e Cultura de Pós-Natal do rato Cerebelar Granule Células Progenitoras Neuron e Neurônios
Summary
Aqui apresentamos um método para isolar e cultivar células granulares do cerebelo e neurônio progenitor neurônios granulares do cerebelo de rato pós-natal.
Abstract
O córtex cerebelar é uma estrutura bem descrito que oferece oportunidades únicas para o estudo das propriedades neuronais e 1,2 de desenvolvimento. Dos tipos cerebelar neuronal (células granulares, células de Purkinje e interneurônios inibitórios), neurônios granulares são de longe os mais numerosos e são o tipo mais abundante de neurônios no cérebro de mamíferos. Em roedores, os neurônios granulares do cerebelo são gerados durante as duas primeiras semanas pós-natal a partir de células progenitoras na camada mais externa do córtex cerebelar, a camada granular externa (EGL). O protocolo aqui apresentado descreve técnicas para enriquecer e neurônios granulares cultura e suas células progenitoras da pós-natal do cerebelo de rato. Iremos descrever os procedimentos para obter culturas de pureza aumentando 3,4, o que pode ser usado para estudar a diferenciação de proliferação de células progenitoras em neurônios granulares 5,6. Uma vez que as células progenitoras diferenciar, as culturas também proporcionam uma população homogênea de neurônios granulares para manipulação experimental e caracterização de fenômenos como a sinaptogênese, a função de receptor de glutamato 7, interação com outras células purificadas cerebelar 8,9 ou morte celular 7.
Protocol
Discussion
Este protocolo é baseado em modificações de procedimentos que têm sido descritos na 3,7,11 passado. Há vários pontos importantes a considerar como discutido abaixo.
Os neurônios granulares e células progenitoras aderir dentro de 2 horas de placas. Células saudáveis têm uma morfologia redonda sob o microscópio de contraste de fase 4. Dentro de 24 horas após o plaqueamento, as células saudáveis vai se espalhar uniformemente ao redor as lamelas ou o bem de plástico e formarão processos…
Acknowledgements
Agradecemos a Barbara Carletti e Anna Marie Kenney para sugestões de valor inestimável. H. é suportado pelo Training Grant "Hormônios: Bioquímica e Biologia Molecular", DK07328. Apoiado em parte pelo NIH conceder 5R01 NS16951 (CAM).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell strainer with 70μm mesh pore | BD Biosciences | 352350 | ||
| Spinal Needle | BD | 405182 | 20G x 3-1/2 inches | |
| Poly-D-Lysine mol wt>300,000 | Sigma | P1024 | Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested. | |
| Percoll | Sigma | P-1644 | ||
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Sigma | P4333 | ||
| HBSS | Invitrogen | 14175-103 | Must be calcium and magnesium free. | |
| Neurobasal A-Medium | Invitrogen | 10888-022 | ||
| Glutamax I supplement | Invitrogen | 35050-061 | ||
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | ||
| 12-mm circle coverslips | Carolina Biological Supply | 63-3029 | These are made in Germany by Deckgluder. | |
| 25-mm circle coverslips | Carolina Biological Supply | 63-3037 | These are made in Germany by Deckgluder. | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK 003150 | Kit is good for five isolations. | |
| Permaset scissors | Roboz | RS6782 | ||
| Dumont #5 (Dumostar) | Roboz | RS4978 | ||
| 4-well culture dish | Nunc | 176740 | ||
| 6-well culture dish | Nunc | 140685 |
Riferimenti
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