Выделение и культуры послеродовой мыши мозжечка гранул клеток-предшественников нейронов и нейронов
Summary
Здесь мы представляем метод, чтобы изолировать и культуры мозжечка гранул нейронных клеток-предшественников нейронов мозжечка и гранулы из послеродового мыши.
Abstract
Коре мозжечка является хорошо описывается структура, которая предоставляет уникальные возможности для изучения свойств нейронов и развитие 1,2. Из мозжечка нейронов типов (зернистых клеток, клеток Пуркинье и тормозные интернейроны), гранулы нейроны являются на сегодняшний день самая многочисленная и наиболее распространенный тип нейронов в мозге млекопитающих. У грызунов, мозжечковые нейроны гранулы образуются в течение первых двух послеродовых недель из клеток-предшественников в наружный слой коры мозжечка, внешний слой гранул (EGL). Протокол, представленные здесь описываются методы обогащения и нейронов культуры гранул и их клеток-предшественников из послеродовой мыши мозжечка. Мы опишем процедуры получения культур повышения чистоты 3,4, которые могут быть использованы для изучения дифференциации пролиферирующих клеток-предшественников нейронов в гранулы 5,6. Как только клетки-предшественники дифференцировать, культур также обеспечить однородное население гранул нейронов для экспериментальных манипуляций и характеристику таких явлений, как синаптогенез, глутамат функции рецептора 7, взаимодействие с другими очищенные клетки мозжечка 8,9 или гибель клеток 7.
Protocol
Discussion
Этот протокол основан на модификации процедуры, которые были описаны в прошлом 3,7,11. Есть несколько важных моментов, как описано ниже.
Гранулы нейронов и клеток-предшественников, придерживаются в течение 2 часов обшивки. Здоровые клетки имеют морфологию круглые под фазово-контрастным ми…
Acknowledgements
Мы благодарим Барбара Carletti и Анна Мари Кенни за неоценимую предложения. HYL поддерживается Обучение Грант "Гормоны: биохимии и молекулярной биологии", DK07328. При частичной поддержке гранта NIH 5R01 NS16951 (CAM).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell strainer with 70μm mesh pore | BD Biosciences | 352350 | ||
| Spinal Needle | BD | 405182 | 20G x 3-1/2 inches | |
| Poly-D-Lysine mol wt>300,000 | Sigma | P1024 | Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested. | |
| Percoll | Sigma | P-1644 | ||
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Sigma | P4333 | ||
| HBSS | Invitrogen | 14175-103 | Must be calcium and magnesium free. | |
| Neurobasal A-Medium | Invitrogen | 10888-022 | ||
| Glutamax I supplement | Invitrogen | 35050-061 | ||
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | ||
| 12-mm circle coverslips | Carolina Biological Supply | 63-3029 | These are made in Germany by Deckgluder. | |
| 25-mm circle coverslips | Carolina Biological Supply | 63-3037 | These are made in Germany by Deckgluder. | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK 003150 | Kit is good for five isolations. | |
| Permaset scissors | Roboz | RS6782 | ||
| Dumont #5 (Dumostar) | Roboz | RS4978 | ||
| 4-well culture dish | Nunc | 176740 | ||
| 6-well culture dish | Nunc | 140685 |
Riferimenti
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- Hatten, M. E., Heintz, N. . Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).
- Hatten, M. E., Gao, W. -. Q., Morrison, M. E., Banker, G., Goslin, K. . in Culturing Nerve Cells. , 419-419 (1998).
- Hatten, M. E. . The Journal of Cell Biology. 100 (2), 384-384 (1985).
- Carletti, B., Rossi, F. . Neuroscientist. 14 (1), 91-91 (2008).
- Knoepfler, P. S., Kenney, A. M. . Cell Cycle. 5 (1), 47-47 (2006).
- Manzini, M. C., Joseph, D. J., MacDermott, A. B. . Molecular and Cellular Neuroscience. 35 (2), 328-328 (2007).
- Manzini, M. C., Ward, M. S., Zhang, Q. . Journal of Neuroscience. 26 (22), 6040-6040 (2006).
- Baptista, C. A., Hatten, M. E., Blazeski, R. . Neuron. 12 (2), 243-243 (1994).
- Palay, S. L., Chan-Palay, V. . Cerebellar Cortex: Cytology and Organization. , (1974).
- Messer, A. . Brain Research. 130 (1), 1-1 (1977).
- Ruiz I Altaba, A. . Development. 126, 3205-3205 (1999).
- Wallace, V. A. . Current Biology. 9 (8), 445-445 (1999).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. . Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).
- Solecki, D. J., Liu, X. L., Tomoda, T. . Neuron. 31 (4), 557-557 (2001).
- Powell, S. K., Williams, C. C., Nomizu, M. . Journal of Neuroscience Research. 54 (2), 233-233 (1998).
- Lander, A. D., Fujii, D. K., Reichardt, L. F. . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (7), 2183-2183 (1985).
- Kenney, A. M., Rowitch, D. H. . Molecular and Cellular Biology. 20 (23), 9055-9055 (2000).
- Kenney, A. M., Cole, M. D., Rowitch, D. H. . Development. 130 (1), 15-15 (2003).
- Pons, S., Trejo, J. L., Martinez-Morales, J. R. . Development. 128, 1481-1481 (2001).
