Aislamiento y cultivo de Post-Natal células de ratón cerebelosa gránulo Progenitor neuronas y las neuronas
Summary
Aquí presentamos un método para aislar y cultivar cerebelosa gránulo células progenitoras de neuronas y las neuronas del cerebelo gránulo de ratón postnatal.
Abstract
La corteza del cerebelo es una estructura bien descrito que ofrece oportunidades únicas para el estudio de las propiedades neuronales y 1,2 de desarrollo. De los tipos neuronales del cerebelo (células granulosas, células de Purkinje y las interneuronas inhibitorias), las neuronas granulares son con mucho los más numerosos y son el tipo más abundante de las neuronas en el cerebro de los mamíferos. En roedores, las neuronas del cerebelo gránulo se generan durante las dos primeras semanas después del parto a partir de células progenitoras en la capa más externa de la corteza cerebelosa, la capa granular externa (EGL). El protocolo que aquí se presenta describe las técnicas para enriquecer la cultura y las neuronas granulares y sus células progenitoras de cerebelo de ratón post-natal. Vamos a describir los procedimientos para obtener cultivos de pureza cada vez mayor de 3,4, lo que puede ser usado para estudiar la diferenciación de la proliferación de células progenitoras en 5,6 neuronas granulares. Una vez que las células progenitoras se diferencian, las culturas también proporcionan una población homogénea de las neuronas granulares para la manipulación experimental y caracterización de fenómenos como la sinaptogénesis, la función del receptor de glutamato 7, la interacción con otras células del cerebelo 8,9 purificada o muerte celular 7.
Protocol
Discussion
Este protocolo se basa en modificaciones de los procedimientos que se han descrito en el pasado 3,7,11. Hay varios puntos importantes que tenga en cuenta como veremos a continuación.
Las neuronas granulares y las células progenitoras se adhieren a las 2 horas de la siembra. Las células sanas tienen una morfología redonda bajo el 4 microscopio de contraste. Dentro de 24 horas después de la siembra, las células sanas se distribuye uniformemente en todo el cubreobjetos o el plástico y así se forma los proc…
Acknowledgements
Damos las gracias a Barbara Carletti y Anna Marie Kenney sugerencias invaluable. HYL el apoyo de la Formación Grant "Hormonas: Bioquímica y Biología Molecular", DK07328. Apoyado en parte por el NIH subvención 5R01 NS16951 (CAM).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell strainer with 70μm mesh pore | BD Biosciences | 352350 | ||
| Spinal Needle | BD | 405182 | 20G x 3-1/2 inches | |
| Poly-D-Lysine mol wt>300,000 | Sigma | P1024 | Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested. | |
| Percoll | Sigma | P-1644 | ||
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Sigma | P4333 | ||
| HBSS | Invitrogen | 14175-103 | Must be calcium and magnesium free. | |
| Neurobasal A-Medium | Invitrogen | 10888-022 | ||
| Glutamax I supplement | Invitrogen | 35050-061 | ||
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | ||
| 12-mm circle coverslips | Carolina Biological Supply | 63-3029 | These are made in Germany by Deckgluder. | |
| 25-mm circle coverslips | Carolina Biological Supply | 63-3037 | These are made in Germany by Deckgluder. | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK 003150 | Kit is good for five isolations. | |
| Permaset scissors | Roboz | RS6782 | ||
| Dumont #5 (Dumostar) | Roboz | RS4978 | ||
| 4-well culture dish | Nunc | 176740 | ||
| 6-well culture dish | Nunc | 140685 |
Riferimenti
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