Isolering och odling av postnatal Mouse Cerebellar stamceller Granule Neuron celler och neuroner
Summary
Här presenterar vi en metod för att isolera och kultur cerebellär granulat neuron progenitorceller och cerebellär nervceller granulat från födsel mus.
Abstract
Den cerebellär cortex är en väl beskriven struktur som ger unika möjligheter att studera neuronala egenskaper och utveckling 1,2. Av de cerebellär neuronala typer (granulat celler, Purkinje celler och inhibitoriska interneuron), granulat nervceller är den i särklass mest talrika och är den vanligaste typen av nervceller i däggdjur hjärnan. Hos gnagare är cerebellär granulat nervceller genereras under de två första postnatala veckor från stamceller i det yttersta lagret av cerebellar hjärnbarken, den externa granulat lagret (EGL). Protokollet presenteras här beskriver tekniker för att berika och kultur nervceller granulat och progenitorceller från postnatal musen lillhjärnan. Vi kommer att beskriva procedurer för att få olika kulturer att öka renhet 3,4, som kan användas för att studera differentiering av förökar stamceller till granulat neuroner 5,6. När progenitorceller differentiera, kulturer också ge en homogen population av granulat nervceller för experimentell manipulation och karakterisering av fenomen som synaptogenesis, glutamat receptor funktion 7, samverkan med andra renade cerebellär celler 8,9 eller celldöd 7.
Protocol
Discussion
Detta protokoll är baserad på modifieringar av förfaranden som har beskrivits tidigare 3,7,11. Det finns flera viktiga punkter att notera som diskuteras nedan.
Den granulat neuron och progenitorceller följa inom 2 timmar bordläggningen. Friska celler har en rund morfologi under faskontrastmikroskop 4. Inom 24 timmar efter plätering kommer friska celler jämnt runt täckglasen eller plast väl och kommer att ligga processer. Vid tidpunkten för det första mediet förändras, efter 24 timmar kommer det att…
Acknowledgements
Vi tackar Barbara Carletti och Anna Marie Kenney för ovärderliga förslag. HYL stöds av Training Grant "Hormoner: biokemi och molekylärbiologi", DK07328. Stöds delvis av NIH bidraget 5R01 NS16951 (CAM).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell strainer with 70μm mesh pore | BD Biosciences | 352350 | ||
| Spinal Needle | BD | 405182 | 20G x 3-1/2 inches | |
| Poly-D-Lysine mol wt>300,000 | Sigma | P1024 | Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested. | |
| Percoll | Sigma | P-1644 | ||
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Sigma | P4333 | ||
| HBSS | Invitrogen | 14175-103 | Must be calcium and magnesium free. | |
| Neurobasal A-Medium | Invitrogen | 10888-022 | ||
| Glutamax I supplement | Invitrogen | 35050-061 | ||
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | ||
| 12-mm circle coverslips | Carolina Biological Supply | 63-3029 | These are made in Germany by Deckgluder. | |
| 25-mm circle coverslips | Carolina Biological Supply | 63-3037 | These are made in Germany by Deckgluder. | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK 003150 | Kit is good for five isolations. | |
| Permaset scissors | Roboz | RS6782 | ||
| Dumont #5 (Dumostar) | Roboz | RS4978 | ||
| 4-well culture dish | Nunc | 176740 | ||
| 6-well culture dish | Nunc | 140685 |
Riferimenti
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- Hatten, M. E., Heintz, N. . Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).
- Hatten, M. E., Gao, W. -. Q., Morrison, M. E., Banker, G., Goslin, K. . in Culturing Nerve Cells. , 419-419 (1998).
- Hatten, M. E. . The Journal of Cell Biology. 100 (2), 384-384 (1985).
- Carletti, B., Rossi, F. . Neuroscientist. 14 (1), 91-91 (2008).
- Knoepfler, P. S., Kenney, A. M. . Cell Cycle. 5 (1), 47-47 (2006).
- Manzini, M. C., Joseph, D. J., MacDermott, A. B. . Molecular and Cellular Neuroscience. 35 (2), 328-328 (2007).
- Manzini, M. C., Ward, M. S., Zhang, Q. . Journal of Neuroscience. 26 (22), 6040-6040 (2006).
- Baptista, C. A., Hatten, M. E., Blazeski, R. . Neuron. 12 (2), 243-243 (1994).
- Palay, S. L., Chan-Palay, V. . Cerebellar Cortex: Cytology and Organization. , (1974).
- Messer, A. . Brain Research. 130 (1), 1-1 (1977).
- Ruiz I Altaba, A. . Development. 126, 3205-3205 (1999).
- Wallace, V. A. . Current Biology. 9 (8), 445-445 (1999).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. . Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).
- Solecki, D. J., Liu, X. L., Tomoda, T. . Neuron. 31 (4), 557-557 (2001).
- Powell, S. K., Williams, C. C., Nomizu, M. . Journal of Neuroscience Research. 54 (2), 233-233 (1998).
- Lander, A. D., Fujii, D. K., Reichardt, L. F. . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (7), 2183-2183 (1985).
- Kenney, A. M., Rowitch, D. H. . Molecular and Cellular Biology. 20 (23), 9055-9055 (2000).
- Kenney, A. M., Cole, M. D., Rowitch, D. H. . Development. 130 (1), 15-15 (2003).
- Pons, S., Trejo, J. L., Martinez-Morales, J. R. . Development. 128, 1481-1481 (2001).
