Asidik pH ve Alpha-Expansin İndüklenmiş Ölçüm Bitki Hücre Duvarı Uzantısı (Creep)

Burada, hücre duvarı genişletme geometrisi ile genişlik ve aktiviteyi ölçmek için yöntemler gösteriyoruz. Doğal hücre duvarlarına bağlı endojen genişlemeler tarafından katalize edilen indüklenmiş uzantıdaki asidi ölçmek için E TATed salatalık tohumu şeritlerinin hipo havuzlarından uygun duvar örnekleri hazırlanabilir. Duvarları nötr tamponda sıkıştırıyoruz ve asidik pH genleşmelerine geçildiğinde bir ekstansometre aktive oluyor ve hücre duvarları hızla uzuyor.

Ayrıca bir genişleme sulandırma testi de gösteriyoruz. Bu kısım için, endojen genleşmeleri denatüre etmek için kısa bir ısıl işlem kullanıyoruz. Isı ile inaktive edilmiş hücre duvarları asidik bir tamponu bile uzatmaz, ancak genleşme ilavesi duvarın uzayabilirliğini hızla geri kazandırır.

Merhaba, ben Penn State Üniversitesi biyoloji bölümünde Dr.Daniel Cosgrove'un laboratuvarından Dan De Roko. Bugün size izole edilmiş bitki hücre duvarlarının geri dönüşü olmayan uzamasını veya sürünmesini ölçmek için bir prosedür göstereceğiz. Öyleyse başlayalım.

Deneyimlerimize göre, etlenmiş salatalık fidelerinden elde edilen genç hipo avokado, uygun bir hücre duvarı materyali kaynağı olarak hizmet eder. Bu deneyler için salatalık tohumları, karanlık bir dolapta ve 26 santigrat dereceye ayarlanmış sabit sıcaklıktaki bir odada tutulan ışık geçirmez bir kutuda ıslak kağıda dikilir. 22 ila 30 santigrat derece arasındaki sıcaklıklar da işe yarayacaktır, ancak sıcaklığın büyüme oranını belirleyeceğine dikkat etmek önemlidir.

Sıcaklık ne kadar sıcak olursa, fideler o kadar hızlı gelişir. Karanlık bir büyüme ortamının sürdürülmesi çok önemlidir, çünkü küçük miktarlarda ışık bile hem fide gelişim oranını hem de bu teknikle ölçtüğümüz hücre duvarı özelliklerini etkiler. Üçüncü günde, fide gelişimini kontrol etmek için loş yeşil filtreli bir ışık kullanarak kutuya göz atabilirsiniz.

Genellikle üçüncü veya dördüncü günde kutuya göz attığınızda, yaklaşık beş santimetre uzunluğa kadar büyümüş fideler bulacaksınız, bu genellikle deneylerimiz için kullandığımız şeydir. Bu fideler kullanımdan önce eksi 80 santigrat derecede dondurulabilir Hücre duvarı örneklerini hazırlamaya başlamak için, sekiz ila 10 donmuş kesilmiş fideden oluşan küçük gruplar dondurucudan negatif 80 santigrat derece dondurucu bloğu içeren yalıtımlı bir kaba aktarılır. Başparmak ve işaret parmağını kaplamak için kalın bir karbo bulamacı tozu kullanılarak, hipo coddle'ın kütikül kaplaması, hipo coddle'ın başparmak ve işaret parmağı arasında tekrar tekrar kurutulmasıyla çıkarılır.

Bu tekniği uygularken epidermal tabakaya zarar vermeden kütikülün nüfuz etmesini sağlayacak doğru miktarda basınç kullanmak çok önemlidir. Ayrıca hızlı bir şekilde çalışılmalıdır, çünkü donmuş hipo coddle çözüldükçe, yapışan karakumun çoğunu çıkarmak zorlaşır ve pul pul dökülür. Aşındırılan hipo coddle daldırılır ve daha sonra kalan hipo coddles hazırlanırken buzlu su üzerinde saklanır.

Tüm fidelerde kütikül çıkarıldıktan sonra, yeni bir tek çıkıntılı tıraş bıçağı ile genellikle 1,2 santimetre olmak üzere istenen uzunlukta kesilir ve ardından hizalamadan sonra bir cam slayt üzerine hizalanır. Sekiz ila 10 numunelik grubun üzerine ikinci bir cam slayt yerleştirilir ve beş dakika boyunca cam slaytın üzerine 400 ila 500 gram ağırlığında bir ağırlık yerleştirilir. Genellikle uygun miktarda su ile doldurulmuş bir beher kullanırız.

Beherin ağırlığı, hücre özsuyunu çıkarmak ve kenetlemeyi kolaylaştırmak için hücre duvarlarını düzleştirecektir. Deneye bağlı olarak, hipo coddles bu noktada kısa bir ısıl işlemle etkisiz hale getirilebilir. Bunu yapmak için, cam slaytları bir çift lastik bantla birbirine bağlarız, düzeneği oda sıcaklığında yüz mililitre deiyonize su içeren bir kaba koyarız ve mikrodalga fırınımızla tam güçte bir mikrodalga fırına yerleştiririz.

Su yaklaşık 50 saniyede kaynamaya başlar ve kaynama başladıktan 15 saniye sonra mikrodalgayı durdururuz, sıcak su hızla dökülür ve denatürasyonu durdurmak için soğuk su ile değiştirilir. Optimum ısıtma, numunelerin düşük pH'a herhangi bir yanıt vermeyeceği ve aynı zamanda zayıflamayacağı ve kolayca kırılmayacağı anlamına gelecektir. Duvar numuneleri şimdi sabit bir kuvvet X ekstansometresi ile sıkıştırılır.

Bu, duvar numunesinin bazal ucunu tutmak için bir pleksiglas arşın ve numunenin APIC ucuna bağlı hareketli bir kelepçeden oluşan özel yapım bir cihazdır. Hareketli kelepçe, bir konum sensörünün, bir LVDT'nin veya doğrusal değişken diferansiyel transformatörün açık bobinlerinden geçen bir çubuğun ucuna monte edilir. Bu, çubuğa bağlı küçük bir metal silindirin veya çekirdeğin konumunu elektronik olarak algılar.

Çubuğun üst ucu, ayarlanabilir bir karşı ağırlığa sahip bir kola bağlıdır. Bu kol, duvar numunesi üzerinde ayarlanabilir miktarda yukarı doğru kuvvet uygular. Kuvvet, hücre duvarı genişlemesinin ölçümü için numuneler hazırlamak üzere kolun uzak ucuna kalibre edilmiş metal ağırlıklar eklenerek veya çıkarılarak ayarlanır.

Hypo cotto numunesinin bazal ucu ince forseps ile alınır, APIC ucu yaklaşık iki ila üç milimetre içinde hareketli kelepçenin açık çeneleri arasına yerleştirilir. Bu kelepçe yaylı bir timsah kelepçesidir. Metal yüzey ile tampon çözeltisi veya duvar numunesi arasında doğrudan teması önlemek için metal çeneler plastikle kaplanmıştır.

Deneyimlerimize göre, metal iyonları kelepçeden sızabilir ve duvarın uzama kabiliyetini engelleyebilir ve bu nedenle hareketli kelepçe tertibatını bir elimizde tutarak metali kapalı tutarız, duvar numunesinin bazal ucu şimdi pleksiglas vete'nin iki menteşe parçası arasında manevra yapılır ve vete parçaları bir araya getirilir ve sıkıca vidalanır, böylece duvar numunesinin alt ucunu vete içinde kilitler. Hareketli kelepçe tertibatı şimdi nazikçe serbest bırakılır ve karşı ağırlıkların tüm kuvvetinin duvar numunesine aktarılmasına izin verir. Salatalık, hipo coddles'tan hazırlanan duvar örnekleri için rutin olarak toplam 20 gramlık bir karşı ağırlık kullanıyoruz.

Diğer duvar malzemeleri veya deneyler farklı ağırlıklar gerektirebilir. QVE tampon ile doldurulur ve QVE'nin konumu bir ayar vidası ile yukarı veya aşağı hareket ettirilir, böylece hareketli kelepçe LVDT ölçüm aralığının alt ucuna getirilir. LVDT'miz bilgisayarın bir veri toplama ünitesine bağlıdır.

Bir bilgisayara paralel olarak bağlanmış sekiz LVDT düzeneğimiz var, bu da aynı anda sekiz duvar örneğini çalıştırmamıza izin veriyor. Bilgisayar, asit kaynaklı uzamanın ölçümü için LVDT düzeneklerinin her birinin konumunu her 30 saniyede bir kaydeder. Isı ile etkisiz hale getirilmeyen doğal duvar numuneleri ile başlıyoruz ve veterinere nötr tampon ekleniyor.

Duvar numuneleri, eklenen gerilime yanıt olarak birkaç dakika uzar, ancak uzatma düşük bir oranda bozulur. Birkaç dakika sonra, bilgisayarımız ya deneyin başlamasından sonra hareketli kelepçenin pozisyonundaki değişiklik olan numunenin uzunluğundaki değişikliği izlememize izin verir ya da pozisyonun zaman türevini izleyebiliriz. Başka bir deyişle, uzatma oranı.

Uzatma hızı zamanla düşük bir değere sabitlenir. Yaklaşık 20 dakika sonra, nötr tampon, bir vakum pompasına bağlı büyük bir ölçü hipodermik iğneden yapılmış ince bir metal boru kullanılarak çıkarılır. Arabelleği hızlı bir şekilde çıkarmak için.

Kurulum, duvarda veya mekanik düzenekte minimum rahatsızlık ile tamponun çıkarılmasına izin verir. Asidik tampon daha sonra asidik tampona tam değişimi sağlamak için bazen bir ila iki hızlı değişimle eklenir. Sonra arkamıza yaslanıp duvarın tepkisini izliyoruz.

Tipik olarak, daha hızlı uzatma oranını birkaç dakika içinde tespit edebiliriz. 60 dakika sonra, genellikle uzatma yanıtını değerlendirmek için yeterli bilgiye sahibiz, ancak bazı durumlarda ölçümler daha uzun sürelere uzayabilir. Genleşme kaynaklı hücre duvarı uzantısının ölçümü için, ısıyla inaktive edilmiş duvar numuneleri ile başlarız ve qve'ye asidik tampon eklenir.

İlk deneyde olduğu gibi, hücre duvarı uzama hızı, fonksiyonel genişleme eksikliği nedeniyle yavaş yavaş düşük bir değere stabilize olur. Yaklaşık 20 dakikalık genleşmeden sonra, 10 ila 20 mikrolitre genleşmeli bir solüsyon ile Q vet'teki tampon ile spiking yoluyla Q vet'e protein eklenir. Kütikülün çıkarıldığı göz önüne alındığında, genişleme hücre duvarı örneğine hızla nüfuz eder ve birkaç dakika içinde uzama hızının arttığını görürüz.

Bu uzantı yanıtı bir saat veya daha uzun süre takip edilebilir. Endojen genişlemeler ve genişlemelerin eklenmesi nedeniyle hücre duvarı uzamasını nasıl ölçeceğinizi az önce gösterdik. Bu prosedürü yaparken, uzama eğrilerinde gürültü oluşturacakları için mekanik titreşimleri ve sıcaklık dalgalanmalarını minimumda tutmayı unutmamak önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve uzatma tahlillerinizde iyi şanslar.