טיהור של המיטוכונדריה מתאי שמרים

פרוטוקול זה מתחיל בהמרת תאי שמרים לפלטות Sphero על ידי עיכול דופן התא עם ליאז סימול, לאחר מכן פלטות הספרו הומוגניות באמצעות הומוגנייזר טפלון מזכוכית. ההומוגנאט שנוצר נתון פעמיים לצנטריפוגה, לגלולה, תאים לא שבורים, גרעינים ופסולת גדולה. לאחר מכן, הסופרנטנט שנוצר עובר צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-12,000 Gs למשקע מיטוכונדריה.

לבסוף, החלק המיטוכונדריאלי הגולמי שעדיין מכיל אברונים אחרים נתון לצנטריפוגה למשך 60 דקות ב-134,000 Gs בשיפוע צפיפות סוכרוז, מיטוכונדריה טהורה נטולת זיהום על ידי אברונים אחרים מתאוששת בממשק של 60% משקל לנפח ו-32% משקל לנפח סוכרוז. היי, אני ד"ר כריסטופר גרג מהמעבדה של ד"ר ולדימיר טקו במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת קונקורדיה. היום אני הולך להראות לכם כיצד לבודד את המיטוכונדריה מהשמרים scro mysia.

אנו עושים זאת כדי לחקור את הדינמיקה ואת השינויים הקשורים לגיל המתרחשים במיטוכונדריה. ככל שהתאים מזדקנים, אנו הולכים להסתכל על שינויים בפרוטאום, בשומנים ובדנ"א של המיטוכונדריה. אז בואו נתחיל.

התחל את הפרוטוקול הזה על ידי גידול זן השמרים בעשר צלוחיות של מאתיים וחמישים מיליליטר. כל אחד מהם מכיל 50 מיליליטר מדיום YP בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם טלטול סיבובי למשך 48 שעות. לאחר מכן, שפכו את התרבית לצינורות צנטריפוגה של 500 מיליליטר.

קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-3000 גרם בטמפרטורת החדר, שפכו את הסופרנטנט והחזירו את התאים הגלולים ב-250 מיליליטר של צנטריפוגת מים מזוקקים את התאים למשך חמש דקות ב-3000 גרם בטמפרטורת החדר. חזור על זה. צעד השעו מחדש את התאים הגלולים ב -250 מיליליטר מים מזוקקים וצנטריפוגה למשך חמש דקות.

ב-3000 גרם בטמפרטורת החדר, שקלו את גלולת התא הרטוב שהתקבלה, ואז השעו מחדש את התאים הגלולים במאגר DTT העבירו את תרחיף התא לבקבוק של 250 מיליליטר. סובב את הבקבוק ב-70 סל"ד ב-30 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר 20 הדקות, קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-3000 Gs בטמפרטורת החדר, השעו את התאים הגלולים במאגר Xs ללא Xs וצנטריפוגה למשך חמש דקות.

ב-3000 Gs בטמפרטורת החדר, resus משהה תאים גלולים במאגר Zy ללא Xs שוב ומעביר את תרחיף התא לבקבוק זכוכית. הוסף את אבקת ה-zy liase 100 T לתרחיף התא וסובב ב-70 סל"ד בשייקר של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ה-Zy liase 100 T יעכל את דפנות התא ליצירת פלטות Sphero. כל השלבים לאחר עיכול ה- X שהוצג קודם לכן צריכים להתבצע בארבע מעלות צלזיוס או על קרח.

יש לטפל בעדינות בהשעיות של splats באמצעות פיפטות עם קצות חתוכים כדי למנוע שבירת אברונים. עם השלמת עיכול ה-XMO של 30 דקות, העבירו את פלטות ה-Sphero לצנטריפוגה של צינורות צנטריפוגה מפלסטיק של 50 מיליליטר למשך שמונה דקות ב-2200 Gs בארבע מעלות צלזיוס ראוס השעו את ה-S splats הגלולות בצנטריפוגת חיץ הומוגניזציה קרה כקרח. ה-S נשפך במשך שמונה דקות ב-2200 Gs בארבע מעלות צלזיוס.

Resus תלו את הכדור הכדורי בקרח. הומוגניזציה קרה חוצצת ומעבירה תאים להומוגניזטור זכוכית מקורר מראש. בעזרת עלי הדוק הומוגניזציה של התאים על ידי ביצוע 15 משיכות של העלי.

הוסף נפח שווה אחד של מאגר הומוגניזציה קר כקרח לפלטות ה-S ההומוגניות, והעביר אותם לצינורות צנטריפוגה מפלסטיק של 50 מיליליטר. צנטריפוגה ההומוגנית מתפוצצת למשך חמש דקות ב-1500 Gs בארבע מעלות צלזיוס לגלולה, תאים לא שבורים, גרעינים ופסולת גדולה. שופכים את הסופרנטנט שהתקבל לצינורות וצנטריפוגה חדשים למשך חמש דקות.

ב-3000 גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה הזו, הסופרנטנט שנוצר למשך 15 דקות ב-12,000 Gs בארבע מעלות צלזיוס, מזלפים את הסופרנטנט ומשהים את הכדור בקרח. צנטריפוגת חיץ הומוגניזציה קרה.

הכדור המושהה למשך חמש דקות ב-3000 גרם בארבע מעלות צלזיוס. לבסוף צנטריפוגה את הסופרנטנט שנוצר למשך 15 דקות. ב-12,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס מרוקנים את הסופרנטנט והרסוס משהים את הכדור בשלושה מיליליטר של קור קרח.

מאגר SEM. תרחיף זה הוא השבר המיטוכונדריאלי הגולמי. למרות שהוא מועשר במיטוכונדריה, הוא מכיל גם אברונים אחרים כמו הרטיקולום האנדופלזמי או מיקרוזומים GOGI ו- VAs כדי לקבל מיטוכונדריה טהורה.

ההשעיה תהיה כפופה לפיצול נוסף כמתואר בסעיף הבא. כדי להתחיל בפיצול של התרחיף המיטוכונדריאלי הגולמי לקבלת מיטוכונדריה טהורה, הניחו 1.5 מיליליטר קר כקרח, 60% משקל לנפח. סוכרוז במאגר em לתוך צינור צנטריפוגה Beckman UltraClear.

לאחר מכן, כסו בעדינות את 60% הסוכרוז עם ארבעה מיליליטר של 32% סוכרוז, 1.5 מיליליטר של 23% סוכרוז ו-1.5 מיליליטר של 15% סוכרוז בכל משקל לנפח בהם. מאגר מניח שלושה מיליליטר מהחלק המיטוכונדריאלי הגולמי במאגר SEM על גבי 15% משקל לנפח. צנטריפוגת סוכרוז ברוטור דלי מתנדנד של בקמן SW 41 TI למשך שעה אחת ב-134,000 Gs או 33,000 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הצנטריפוגה, המיטוכונדריה השלמה תיצור פס חום בממשק סוכרוז של 60% עד 32%. הסר בזהירות את הסוכרוז עד שהוא מגיע לרצועה המיטוכונדריאלית בעזרת פיפטה עם קצה חתוך, הסר את הרצועה המיטוכונדריאלית והנח אותה בצינור צנטריפוגה של בקמן. עבור רוטור MLS 5, מלאו את הצינור בכדור חיץ SEM, המיטוכונדריה הטהורה על ידי צנטריפוגה ברוטור MLS 5 ב-10,000 GS או 31,000 סל"ד למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס שפכו את הסופרנטנט.

המיטוכונדריה הטהורה הזו יכולה לשמש כעת לניתוחים של תפקודי מיטוכונדריה, פרוטאום מיטוכונדריאלי ו-DNA ליפידי ומיטוכונדריאלי. המקטע המיטוכונדריאלי הגולמי בנתיבים השמאליים והמיטוכונדריה שטוהרו על ידי צנטריפוגה בשיפוע צפיפות סוכרוז בנתיבים הימניים היו נתונים לדף SDS וכתמים חיסוניים עם נוגדנים לסמני חלבון של אברונים שונים. נוכחות המיטוכונדריה בשני התכשירים אושרה על ידי PO one P ו-COX one p תגובתיות חיסונית הצביעה על נוכחות של DP M1 P, FO 13 p ו-VPS 10 P, המייצגים חלבוני רשתית אנדופלזמית, אולארית ו-GOGI בהתאמה בחלק המיטוכונדריאלי הגולמי.

לעומת זאת, חלבוני סמן אלה לא זוהו במיטוכונדריה המטוהרת, מה שמאשר שהפרוטוקול הניב מיטוכונדריה נקייה מזיהום על ידי אברונים אחרים. אז זה עתה הראינו לכם כיצד לבודד את המיטוכונדריה מהשמרים. רק זכרו כשאתם מריצים את הניסוי הזה לא לתת לתאים לדגור ב-100 T במשך יותר מחצי שעה מכיוון שאתם מסתכנים בפירוק חלבוני הממברנה או חלבוני האברונים שעשויים להיות נוכחים בתאים.

זה יכול להיות בגלל פרוטאזות הקיימות במגיב. כמו כן, כאשר אתם עומדים לבודד את המיטוכונדריה ואת שיפוע הסוכרוז, אתם יכולים להקפיא את המיטוכונדריה הללו במינוס 20 מעלות לפני שתעשו זאת ואז להפשיר אותם לפני שתהיו מוכנים לבצע את שלב הצנטריפוגה. אז זהו.

בהצלחה בניסויים שלך.