荧光标记的果蝇心结构

大家好，我是来自伯纳姆医学研究所发育与衰老项目 Ralph Boer 实验室的 Nikita Ari。我是 Gil ler，也是来自底层实验室的。今天，我们将向您展示 Laval 和成人 Presolar 心脏结构的荧光标记程序。

我们在实验室中使用该程序来准备心脏管，以便通过共聚焦或荧光显微镜进行形态学和结构分析，以便对成年果蝇中的心脏结构进行荧光标记。首先，在半完整成人的胸部和腹部之间做一个切口，以分离身体部分。然后修剪成人角质层的悬垂腹侧边缘。

接下来，用一抗和二抗转移和标记成虫或解剖的幼虫标本。通过握住角质层边缘并将其中心面朝下放在盖玻片上的一滴载体盾上来标记洗涤的成年标本后，将盖玻片倒置到一滴培养基上，两侧是载玻片上的两个盖玻片以形成一个桥。心脏现在直立悬挂，用于安装幼虫心脏。

将标本转移到载玻片上，腹侧朝下，在载玻片的两侧安装两个盖玻片。最后，先将第三个盖玻片放在靠近幼虫后端的盖玻片上，与第三个盖玻片形成一个桥。心脏现在可以进行成像了。

在开始此程序之前，准备以下含有 A DH 的 A DH 松弛缓冲液，如本系列的另一个视频方案中所述，其中含有 10 毫摩尔 EGTA 固定剂，该固定剂由 4% 甲醛组成，溶于一个 X-P-B-S-SP-BS，TX，以及适当稀释的一抗和荧光标记的二抗。在 PBS TX 中，解剖成体和幼虫果蝇，以暴露半完整的果蝇心脏准备，如视频方案所示，可视化果蝇幼虫和果蝇幼虫 NMJ 解剖方案中跳动的心脏。但经过修改，在幼虫解剖过程中使用含氧 DH，并将后针从腹侧中线幼虫略微移位。

沿腹中线切开。在以下步骤中，固定前不要去除任何组织。通过在显微镜下检查所有心脏在含氧 A DH 中是否有节奏地收缩和放松来开始标记程序。然后迅速用松弛缓冲液替换 DH 并重新检查每根心脏管，以确保收缩得到抑制。

通过用固定剂替换松弛缓冲液来继续固定心形。在室温下轻轻摇动孵育 20 分钟。请注意，对于幼虫制剂，在任何步骤都不需要摇晃，甚至可能对心脏组织的完整性有害。

20 分钟后，取出固定剂，用 P-B-S-T-X 洗涤标本 3 次，每次 10 分钟。在室温下，成人持续摇晃，小心干净地在腹部和胸部之间做一个切口。将两个身体部分分开，以确保对心脏前部区域的损伤最小。

小心不要切入心脏锥形腔所在的前腹部分。在显微镜下检查标本，以确保切割干净。接下来，小心地修剪腹部角质层的任何悬垂腹侧边缘，使剩下的部分更呈椭圆形，不那么圆。

对于使用细镊子的幼虫心脏，小心地去除脂肪体。请极其小心地执行此作。由于幼虫心脏特别脆弱，并且几乎没有其他肌肉或结缔组织的支撑，因此不要去除气管分支，因为这可能会损害心脏。

接下来，与一抗一起孵育，一抗在 PVS TX 中稀释，并以 50 μL/孔的 96 孔板分配。对于成蝇，握住修剪过的背角质层的边缘，不要接触位于中央的心脏管并转移到板上。每孔放置不超过 12 个样品，并在室温下孵育 2 小时，同时持续搅拌。

使用镊子握住幼虫标本的边缘，并转移到填充的 P-B-S-T-X 中。同样，不要在孵化结束时摇晃幼虫标本。去除一抗溶液。

最后一次在补充有 Alexa 5 9 4 Phin 的 PBS tx 中洗涤 100 μL 二抗后，在室温下用 100 μL P-B-S-T-X 洗涤心脏 3 次，每次 10 分钟。从现在开始，请盖上样品以防止氟 4 漂白，并在室温下孵育 1 小时。取出二抗溶液，在室温下用 100 μL P-B-S-T-X 洗涤心脏 3 次，每次 10 分钟。

最后，用 100 微升 PBS 冲洗心脏 10 分钟，以去除 TRITTON X 100。标本可以在摄氏 4 度的黑暗中存放数天，然后再进行镶嵌。首先，准备安装滑轨。

将三个均匀分布的。10 微升 vector shield 安装介质滴到显微镜上。将两个 18 x 18 毫米的盖玻片滑到外层液滴上，使盖玻片保持约 10 至 15 毫米的距离。

此外，将 20 微升矢量防护罩放在第三个盖玻片的中心。接下来，握住解剖的成年果蝇的角质层的最边缘。要小心地将其从 PVS 洗涤液中取出，请将其心形面朝下轻轻地放在第三个盖玻片上的封固剂滴上，盖玻片上每滴不超过 5 个心形。

将心形放在盖玻片上的液滴上后，在显微镜下检查以确保所有心形都朝下。现在小心地将盖玻片与心形倒置，并将其快速放在载玻片上，固定一对盖玻片，使包含心脏管的倒盖玻片的液滴与位于盖玻片之间空间中的矢量盾液滴融合。以这种方式配对，三个盖玻片形成一个桥。

心将悬挂在中间盖玻片和显微镜之间。在显微镜下滑到桥下检查，以确保成年果蝇的心脏现在使用指甲油朝上。固定其边缘的盖玻片。

心脏现在已准备好通过荧光或共聚焦显微镜进行成像。要安装幼虫心脏，请使用细镊子将一滴约 20 微升 BTA 防护罩滴在显微镜载玻片上。抓住角质层边缘的幼虫，小心地将其转移到液滴中。

使用钨针将幼虫背侧朝下。在一个载玻片上放置最多两只幼虫。接下来，将每个标本从封固剂中拖出，并将幼虫平行对齐。

使用镊子将盖玻片放在对齐的心脏的每一侧。首先将第三个盖玻片放在顶部，方法是将一侧放在前盖玻片上，然后将其降低到后盖玻片上。从而形成一座桥梁。

毛细管力将导致矢量盾从后向前流动，这有助于幼虫心脏的正确对齐。最后，用指甲油将所有盖玻片的边缘固定到位，并用 20 至 30 微升带有指甲油的矢量盾密封小心地填充盖玻片之间的空间，并在 4 摄氏度下短期储存或在零下 20 摄氏度下储存较长时间。如果执行得当，背血管的所有成分和相关组织应保持完整并易于观察。

成人的背景荧光应最小。腹侧纵肌层染色非常好，并产生大量信号。然而，下面的环状心肌细胞往往不会产生与来自上覆腹层的信号一样强烈的信号。

成人心脏前圆锥形腔的肌细胞含有大量的收缩物质，因此，相对于心脏管的其余部分，该区域看起来最坚固。幼虫心脏的图像显示螺旋状的肌纤维排列。与成人收缩心肌细胞类似，我们刚刚展示了你们用于制备和染色用于荧光和共聚焦显微镜检查的卵形心脏的实验方案。

执行此过程时，请务必记住限制任何不必要的处理。这将确保更好的完整和保存的心脏结构。此协议仅作为起点。

与任何其他免疫组织化学一样，不同的抗体需要不同的条件，需要单独优化。就是这样。感谢您的观看，祝您染色好运。