Name: Un In vitro FluoroBlok Tumore Assay Invasion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Scopri come misurare l'invasione cellulare tumorale con il saggio FluoroBlok in vitro. Questo metodo fluorescente permette di studiare la progressione del cancro e valutare l'interazione delle cellule con la membrana basale.

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Post-etichettatura e la misura utilizzando BD calceina AM colorante fluorescente Le cellule sono etichettati per la quantificazione dopo che hanno invaso attraverso il Matrigel BD Matrix e passato attraverso la membrana BD FluoroBlok. Di conseguenza, solo la misura finale di invasione delle cellule possono essere ottenute. <ol><li> Crescere le cellule a confluenza ~ 80%. </li><li> Preparare e reidratare il sistema di inserimento. <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Rimuovere il pacchetto di stoccaggio da -20 ° C e permettono di venire a temperatura ambiente. </li><li> Aprire la confezione ed aggiungere 500 microlitri caldo (37 ° C), mezzi di comunicazione verso l&#39;interno dei pozzi inserto. Lasciare la piastra per reidratare per 2 ore a 37 ° C, 5% di CO 2. Nota: non è necessario reidratare il patinata BD Falcon FluoroBlok 24-pozzetti sistema Inserire che sarà utilizzato come controllo la migrazione delle cellule. </li><li> Dopo la reidratazione, rimuovere con attenzione il supporto dai pozzetti inserire senza disturbare lo strato di BD Matrigel Matrix sulla membrana. Il sistema è ora pronto all&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparare sospensioni cellulari da trypsinizing monostrati cellulari e risospendere le cellule in DMEM senza siero a 5 x 10 4 cellule / ml. Nota: Se si utilizza un diverso tipo di cellule è necessario determinare la densità ottimale di semina. Per determinare la densità di semina ottimale per il vostro tipo di cellulare su una superficie porosa crescita, utilizzare una gamma di densità di semina (cellule / cm 2) che supporti la densità di semina utilizzati su superfici non porose (es. boccette, piatti e piatti). Per esempio, se attualmente seme a 2,5 x 10 5 cellule / cm 2, seme a concentrazioni di cellule diverse tra 5 x 10 4 e 5 x 10 5 cellule / cm 2 per determinare la densità ottimale di semina iniziale. </li><li> Aggiungere 500 ml di sospensione cellulare (2,5 x 10 4 cellule) alle camere apicale. </li><li> Aggiungere 750 ml di fattore chemiotattico (5% FBS in DMEM) per ciascuna camera basale, utilizzando le porte del campione per l&#39;accesso. </li><li> Incubare il sistema BioCoat BD tumore invasione e la non patinata BD Falcon FluoroBlok 24-pozzetti Plate per 20-22 ore a 37 ° C, 5% CO 2 nell&#39;atmosfera. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, rimuovere con attenzione di media dalle camere apicale. Questo può essere ottenuto sfogliando il contenuto in un contenitore per rifiuti. Non toccare la superficie inferiore del sistema di inserimento. </li><li> Trasferire il sistema di inserire in un secondo 24 pozzetti contenente 500 microlitri / e di 4 mcg / mL calceina AM in HBSS. Incubare per 1 ora a 37 ° C, 5% di CO 2. La soluzione calceina AM non viene rimosso dalla camera bassa prima di leggere la fluorescenza, perché è un colorante nonfluorescent vitale che viene convertito in calceina verde fluorescente dalle esterasi del citosol. </li><li> Fluorescenza delle cellule invase viene letto a lunghezze d&#39;onda di 494/517 nm (Es / Em) su un fondo di lettura lettore di piastre a fluorescenza. L&#39;impostazione di guadagno potrebbe essere necessario essere determinati empiricamente, ma un guadagno punto centrale dovrebbe essere un punto di partenza sufficiente. Un guadagno che è troppo alto può portare alla saturazione del rivelatore con il campione altamente fluorescenti, questo può impedire l&#39;acquisizione di risultati significativi. L&#39;uso di autogain (se supportato dal lettore) non è raccomandato. Un microscopio invertito a fluorescenza può essere usato per verificare i risultati, ma è particolarmente utile per fare questo la prima volta che si esegue questo test. Nota: E &#39;della massima importanza che i sistemi di inserti vengono letti utilizzando la mappa corretta piatto. Per informazioni sulle mappe di carico piatto vedere BD Bollettino tecnico n ° 436 il www.bdbiosciences.com o contattare il supporto tecnico BD (labware@bd.com). L&#39;orientamento corretto piastra è ben A1 in alto a sinistra e il logo BD Flacone orientata a destra, come il piatto viene inserito nel lettore. </li></ol> Riduzione dei dati I dati vengono espressi come nella seguente equazione: <img src="/files/ftp_upload/1475/1475eqa.jpg" alt="Equazione" /> Fondo possono essere sottratti prima del calcolo di invasione per cento delle cellule RFU = unità relative fluorescenti.

<ol><li>Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celastrol%2C+a+novel+triterpene%2C+potentiates+TNF-induced+apoptosis+and+suppresses+invasion+of+tumor+cells+by+inhibiting+NF-%CE%BAB-regulated+gene+products+and+TAK1-mediated+NF-%CE%9AB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-κB-regulated gene products and TAK1-mediated NF-ΚB activation.</a> Blood. 109, 2727-2735 (2007).</li>
<li>Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evodiamine+Aboloishes+Constitutive+and+Inducible+NF-%CE%BAB+Activation+by+Inhibiting+I%CE%BAB%CE%B1+Kinase+Activation%2C+Thereby+Suppressing+NF-%CE%BAB-regulated+Antiapoptotic+and+Metastatic+Gene+Expression%2C+Up-regulating+Apoptosis%2C+and+Inhibiting+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-κB Activation by Inhibiting IκBα Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-κB-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion.</a> J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).</li>
<li>Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+cysteini+residues+in+I%CE%BAB%CE%B1+kinase+and+NF-%CE%BAB+%28p65%29+by+xanthohumol+leads+to+suppression+of+NF-%CE%BAB-regulated+gene+products+and+potentiation+of+apoptosis+in+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Modification of the cysteini residues in IκBα kinase and NF-κB (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-κB-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells.</a> Blood. , 113-2003 (2009).</li>
<li>Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. eguelin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((an+Akt+Inhibitor%2C+Suppresses+I%CE%9AB%CE%B1+Kinase+Activation+Leading+to+Suppression+of+NF-%CE%BAB-Regulated+Gene+Expression%2C+Potentiation+of+Apoptosis%2C+and+Inhibition+of+Cellular+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">an Akt Inhibitor, Suppresses IΚBα Kinase Activation Leading to Suppression of NF-κB-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion.</a> J. Immunol. , 177-5612 (2006).</li>
<li>Partridge, J., Qian, S. Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model. Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. 2005 Sept 11-15, Geneva, Switzerland, , (2005).</li>
<li>An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation. US patent. , 6,740,501,B2 (2004).</li>
<li>Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Fluorescent+Cell+Labeling+on+Tumor+Invasion+and+Screening+of+Anti-Metastatic+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Mole.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds.</a> Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).</li>
<li>Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay. Screentech 2001 Conference. 2005 Mar 12-16, San Diego, CA, , (2005).</li>
<li>Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs. Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. 1999 Sept 13-16, Edinburgh, SC, UK, , (1999).</li>
</ol>

Gli autori sono dipendenti della BD Biosciences, che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

<table><tbody><tr><td>Sistema BD BioCoat per l'Invasione Tumorale</td><td>BD Biosciences</td><td>354165 o 354166</td><td></td></tr><tr><td>Cellule HT-1080 e NIH/3T3</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezzo Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle (DMEM; privo di siero)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco&amp;rsquo;s, senza calcio e magnesio (DPBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema BD Falcon FluoroBlok con inserti multi-pozzetto da 24 da utilizzare come controllo della migrazione cellulare</td><td>BD Biosciences</td><td>351157 o 351158</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino fetale al 5% in DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colorante fluorescente BD Calcein AM</td><td>BD Biosciences</td><td>354216 o 354217</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione equilibrata di sali di Hanks&amp;rsquo; (HBSS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre BD Falcon da 24 pozzetti per l'etichettatura post-invasione cellulare</td><td>BD Biosciences</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre a fluorescenza con capacità di lettura dal fondo</td><td>PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un in vitro fluoroblok tumore assay invasion

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

La caratteristica delle cellule metastatiche è la loro capacità di invadere attraverso la membrana basale e migrare in altre parti del corpo. Le cellule devono essere in grado di secernere sia proteasi che degradano la membrana basale e migrare in modo da essere invasiva. BD sistema Tumore BioCoat Invasion fornisce cellule con le condizioni che permettono la valutazione della loro proprietà invasive<em&gt; In vitro</em<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Si compone di un Falcon BD FluoroBlok 24-pozzetti Inserire Piatto con una membrana di 8,0 micron, dimensioni dei pori di PET che è stato uniformemente rivestito con BD Matrigel Matrix. Questo strato uniforme di BD Matrigel Matrix funge da membrana basale ricostituita<em&gt; In vitro</em&gt; Fornire una vera e propria barriera per non invasiva cellule pur presentando una struttura adeguata di proteine ​​per lo studio invasione. Il processo di rivestimento occlude i pori della membrana, il blocco non invasiva cellule migrano attraverso la membrana. Al contrario, le cellule invasive sono in grado di staccarsi da e migrano attraverso la membrana rivestita. La quantificazione di invasione delle cellule può essere raggiunto da una pre-o post-invasione delle cellule di etichettatura con un colorante fluorescente come DiIC<sub&gt; 12</sub&gt; (3) o calceina AM, rispettivamente, e misurando la fluorescenza delle cellule invasori. Poiché la membrana BD FluoroBlok blocca efficacemente il passaggio della luce 490-700 nm a efficienza&gt; 99%, fluorescenza marcata cellule che non hanno invaso non vengono rilevati da un approccio bottom-lettura lettore di piastre in fluorescenza. Tuttavia, le cellule che hanno invaso la parte inferiore della membrana non sono più al riparo dalla sorgente di luce e vengono rilevati con il lettore di piastre rispettivi proprietari. Questo video mostra una cella di test endpoint invasione, utilizzando calceina AM per rilevare le cellule invase.

Questo video dimostra come misurare l&#39;invasione delle cellule attraverso inserti in coltura cellulare utilizzando una metodologia basata fluorescenza.

Un In vitro FluoroBlok Tumore Assay Invasion

Il tratto distintivo delle cellule metastatiche è la loro capacità di invadere la membrana basale e migrare verso altre parti del corpo. Le cellule devono essere in grado di...

L'invasione cellulare è un passaggio importante nella progressione del cancro e nell'angiogenesi. I saggi di invasione in vitro valutano tipicamente la capacità delle cellule di degradare la membrana basale ricostruita, come il BD matrix, il gel matrix, e di migrare attraverso inserti per colture cellulari. Il saggio di invasione tumorale inizia quando le cellule vengono aggiunte agli inserti Fluor block rivestiti con matri gel.Viene aggiunto un agente chemiotattico costituito da membrana basale ricostituita alla camera basale e il sistema viene incubato. Nelle cellule invasive, durante la notte, sarà possibile degradare la barriera di matri gel e attraversare la membrana del blocco flora, una membrana specializzata che protegge il Fluor dalla luce ambiente. Il contenuto della camera apicale viene scartato e l'inserzione multipozzetto viene aggiunta a una seconda piastra contenente un Fluor.Dopo l'incubazione, le cellule vitali vengono colorate e possono essere rilevate sia visivamente che mediante un lettore di micropiastre. Ciao, sono Jeff Partridge di BD Biosciences Discovery LabWare. Oggi vi mostreremo una procedura per il saggio di invasione tumorale con floor block.Utilizziamo questa procedura per studiare l'invasione delle cellule tumorali attraverso una membrana basale in direzione dell'agente chemiotattico. Cominciamo. Coltivare le cellule per il saggio di invasione tumorale fino a raggiungere una confluenza di circa l'80%.In questo esperimento, utilizzeremo le linee cellulari HT 10 80 e N NIH three T three. Le cellule HT 10 80 sono in grado di migrare e invadere la barriera di matrigel nel sistema e pertanto rappresentano ottimi controlli positivi per il saggio. Le cellule NIH three T three non sono invasive, ma sono in grado di migrare e quindi costituiscono ottimi controlli negativi per questa procedura.Per iniziare, l'assay riidrata il sistema rimuovendo il pacchetto del sistema BD BioCoat per l'invasione tumorale dallo stoccaggio a meno 20 gradi Celsius e lasciandolo raggiungere la temperatura ambiente. Poiché l'assay richiede una tecnica sterile, lasciare l'inserto raggiungere la temperatura ambiente all'interno della cappa a flusso laminare. Una volta che il pacchetto ha raggiunto la temperatura ambiente, aprirlo per riidratare la membrana basale attraverso la quale le cellule di interesse potranno migrare.Aggiungere 500 microlitri di mezzo caldo all'interno delle pozzette dell'inserto e lasciare idratare la piastra per due ore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Non è necessario idratare la piastra multi-pozzetta con inserto BD Falcon Flora Block 24 non rivestita, poiché verrà utilizzata come controllo della migrazione cellulare per preparare le cellule al saggio di invasione. Trasferire in tripsina i monostrati cellulari e risospendere le cellule in DMEM privo di siero a una concentrazione di cinque volte 10 alla quattro cellule per millilitro.Se viene utilizzato un tipo cellulare diverso, la densità di semina ottimale deve essere determinata empiricamente. Dopo la reidratazione della piastra rivestita, rimuovere con attenzione il mezzo dai pozzetti dell'inserto senza disturbare lo strato di gel di MA sulla membrana. Il sistema è ora pronto per essere utilizzato.Non permettere al gel di MA di seccarsi. Per iniziare il saggio di invasione cellulare, aggiungere 500 microlitri di ciascuna sospensione cellulare nelle camere apicali del sistema di invasione tumorale sia nelle configurazioni rivestite che non rivestite con matrigel. Successivamente, utilizzando i porti di campionamento per l'accesso, aggiungere 750 microlitri di chemiotattrante nelle camere basali sia nelle piastre rivestite che non rivestite.È estremamente importante non introdurre bolle durante il riempimento delle camere basali. Come controllo della migrazione, aggiungere ogni sospensione cellulare e il chemiotattrante nella piastra BD Falcon Flora Block 24 Multi WA con inserti non rivestiti. Incubare il sistema per l'invasione tumorale e la piastra Falcon Flora Block 24 Multi WA con inserti non rivestiti per 20-22 ore a 37 gradi Celsius, in atmosfera di anidride carbonica al 5% il giorno successivo.Al termine dell'incubazione, le cellule sono pronte per essere marcate con un colorante fluorescente al calcio am. Rimuovere con attenzione il mezzo dai camere apicali rovesciando il contenuto in un contenitore per rifiuti. Successivamente, trasferire immediatamente il sistema di inserto in una seconda piastra a 24 pozzetti contenente 500 microlitri per pozzetto di quattro microgrammi per millilitro.Calcio am nella soluzione salina equilibrata di Hank. Ripetere questi passaggi con il controllo della migrazione. Incubare le piastre per un'ora a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica.Non toccare la superficie inferiore del sistema di inserto. Al termine dell'incubazione di un'ora con il calcio, la fluorescenza delle cellule invasive può essere misurata. È di fondamentale importanza che i sistemi di inserto vengano letti utilizzando la mappa della piastra corretta.L'orientamento corretto della piastra prevede che il pozzetto A1 si trovi nell'angolo superiore sinistro e che il logo BD Falcon sia orientato verso destra quando la piastra viene inserita nel lettore. La fluorescenza viene letta a lunghezze d'onda di 494 e 517 nanometri mediante un lettore di piastre a fluorescenza con lettura dal fondo. È consigliabile verificare i risultati ottenuti mediante microscopio a fluorescenza invertito per assicurarsi che i dati del lettore di piastre corrispondano ai risultati visivi. Questi sono dati tipici ottenuti da un lettore di piastre per una piastra rivestita e una piastra di controllo non rivestita, provenienti da saggi di invasione cellulare effettuati con le due linee cellulari HT 10 80 e NIH 3T3.I dati provenienti da pozzetti senza cellule rappresentano lo sfondo, che può essere sottratto prima del calcolo della percentuale di invasione cellulare. Calcolare la percentuale di invasione utilizzando la seguente equazione. La percentuale di invasione corrisponde alla media delle unità fluorescenti relative o rfu delle cellule che hanno attraversato la membrana rivestita con matrigel in direzione dell'agente chemiotattico.Questo valore viene diviso per il valore medio di RFU delle cellule che si sono migrate attraverso la membrana del blocco VD non rivestita verso l'agente chemiotattico. Questo valore viene quindi moltiplicato per 100. Questo grafico mostra il confronto tra la percentuale di invasione cellulare delle cellule HT 10 80 e delle cellule NIH 3T3; come si può osservare, le cellule HT 10 80 sono invasive, mentre le cellule NIH 3T3 non lo sono.Quando le cellule vengono osservate al microscopio fluorescente invertito, i risultati sono coerenti con quelli ottenuti dal lettore di piastre. Le cellule invasive HT 10 80 hanno invaso attraverso il matrigel e inoltre migrato attraverso la membrana non rivestita. Al contrario, le cellule non invasive NIH 3T3 non hanno invaso il matrigel, ma hanno migrato attraverso la membrana non rivestita.Abbiamo appena mostrato come eseguire un saggio di invasione tumorale con blocco florale. Durante questa procedura, è importante mantenere le piastre in posizione orizzontale e ridurre al minimo la formazione di bolle. Queste potrebbero influenzare i risultati.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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