البصرية تسجيل النشاط الكهربائي في غينيا الخنازير المعوية باستخدام شبكات الجهد حساسة ملونات

يوضح هذا الفيديو عملية تشريح وتصوير تحضيرات الجهاز العصبي المعوي المحفزة كهربائيًا باستخدام صبغة D-4-ANEPPDHQ الحساسة للجهد. يتم أخذ جزء صغير من أمعاء خنزير غينيا تم قتله رحيمًا، ثم يتم تشريحه للكشف أولاً عن الطبقة تحت المخاطية، وصولاً إلى الضفيرة العضلية المعوية لإجراء التسجيلات البصرية. يتم وضع الأقطاب الكهربائية على النسيج المثبت والمصبوغ بـ D-4-ANEPPDHQ بعد التقاط صورة أولية عالية الدقة.

يتم تسجيل التغيرات البصرية التي تشير إلى النشاط الكهربائي بواسطة كاميرا عالية السرعة. وأثناء عملية الالتقاط عالية السرعة، يتم تطبيق التحفيز الكهربائي. بعد ذلك، يتم دمج الصورة عالية الدقة فوق خريطة البكسل الخاصة بالكاميرا عالية السرعة لتحليلها باستخدام neuro plex.

مرحباً، أنا برايان سالزبيرج، مدير مختبر البصريات الخلوية (Laboratory of Cellular Optics) أو "loco" كما نحب أن نسميه، في قسم العلوم العصبية بجامعة بنسلفانيا. اسمي أناليا أوبيد، وأنا أيضاً عضوة في مختبر البصريات الخلوية.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لتسجيل النشاط الكهربائي من شبكات عصبونية ثديية سليمة باستخدام صبغات حساسة للجهد. نستخدم هذا الإجراء لدراسة الترابط العصبي داخل وبين الشبكتين اللتين تشكلان الجهاز العصبي المعوي، والذي يُشار إليه أيضاً باسم الدماغ الثاني أو دماغ الأمعاء. لذا، فلنبدأ.

ابدأ في تحضير مستحضرات تحت المخاطية والضفيرة المعوية عن طريق استئصال الأمعاء الدقيقة لخنزير غينيا من سلالة Hartley، يزن ما بين 150 إلى 200 جرام أو يتراوح عمره بين أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع، بعد تخديره بواسطة isof fluorine عن طريق الاستنشاق ثم قطع الرأس. بعد ذلك، قم بإزالة محتويات الأمعاء عن طريق غسل اللمعة بمحلول M1 99 DM دافئ ومؤكسج. اقطع قطعة من الأمعاء بطول 8 إلى 10 سم، مع الحرص على الحفاظ على القطبية.

انقلها إلى طبق زجاجي بقطر 10 سنتيمتر مغطى بـ sard يحتوي على M1 99 DM بدرجة حرارة الغرفة. ضع الطبق على مجهر تشريحي ذو إضاءة مجال مظلم. ثم باستخدام المقص، افتح الحافة المساريقية واستخدم دبابيس الحشرات لتثبيت قطعة الأمعاء بحيث تكون جهة المخاطية للأعلى.

من المهم للغاية الحفاظ على شد متساوٍ بحيث يظهر النسيج بعد التثبيت بشكل مستطيل مع اصطفاف منتظم لصفوف الزغابات المخاطية، مع إمساك ملقط دومونت (dumont) دقيق ذو رؤوس مستقيمة في وضع أفقي تقريبًا. قم بتقشير المخاطية عن طريق الإمساك بالزغابات عند أحد طرفي القطعة المعوية والسحب على طول المحور الطولي للنسيج. استمر في فصل شرائط المخاطية للكشف عن الطبقة تحت المخاطية التي تحتوي على العقد تحت المخاطية والأوعية الدموية تحت المخاطية.

بعد ذلك، وباستخدام مقص دقيق للغاية، قم بإجراء قطع في الطبقة تحت المخاطية متبعاً اتجاه الألياف العضلية الدائرية. ثم ارفع الطبقة تحت المخاطية برفق شديد باستخدام الملقط الدقيق مع دفع العضلة الدائرية. قم بإزاحة الطبقة لأسفل باستخدام المقص واقطع على طول الحواف الطولية.

قم بتحرير الطبقة تحت المخاطية من بقية العينة مع تقدم عملية الفصل. الآن، قم بإجراء قطع ثانٍ باتباع اتجاه الألياف العضلية الدائرية على مسافة تتراوح بين 1.5 إلى ثلاثة سنتيمترات من القطع الأول لتحديد الحجم النهائي للعينة تحت المخاطية؛ وتكون القطعة تحت المخاطية الناتجة بسمك يتراوح من 30 إلى 50 micrometers وتظهر بمظهر غشائي رقيق. انقلها إلى طبق syl guard آخر يحتوي على M1 99 DM طازج وثبتها بدبابيس بلطف ودون شد.

ثم ضع الطبق في غرفة مُفرغة من الأكسجين في درجة حرارة الغرفة لاستخدامه لاحقاً. يجب أن يكون الجزء المعوي الأصلي الآن خالياً من المخاطية وتحت المخاطية، مع كشف العضلات الدائرية. يُستخدم هذا الجزء الآن للحصول على تحضير للضفيرة التامسيرية للكشف عن الضفيرة التامسيرية.

قم بإزالة أكبر قدر ممكن من طبقة العضلات الدائرية باستخدام ملقط دقيق ذو طرف مستقيم لسحب حزم الألياف من كل جانب من التحضير. لا يمكن فصل الضفيرة العضلية المعرّضة عن الطبقة العضلية الطولية وعن الـ CI الموجود أسفلها. انقل تحضير الضفيرة العضلية إلى طبق جديد مغطى بمادة sard يحتوي على M1 99 M مؤكسج. ثم قم بتثبيت العينة التي تحتوي على عضلات حية باستخدام دبابيس بشكل فضفاض. وقبل دقائق قليلة من التجربة البصرية، انقل التحضير إلى طبق أصغر حجماً ومغطى بمادة syl guard مملوء مسبقاً بـ M1 99 DM يحتوي على 2 µM من nefe لمنع انقباض العضلات، وثبته بإحكام عن طريق وضع عدة دبابيس دقيقة جداً بعناية حول المحيط.

تأكد من توزيع الشد بالتساوي وأن تكون الأنسجة مسطحة تماماً مقابل قاعدة واقي السيليكون. تحضير الأنسجة الآن جاهز للتجارب الفسيولوجية. قم بتحضير محلول مخزون بتركيز يتراوح من 5 إلى 50 µg/mL من DAI four A-N-E-P-P-D HQ في M1 99 M مع 2 µM من nifedipine في قارورة زجاجية وقم بتغطيتها بورق الألومنيوم.

يجب أن يشكل الإيثانول من المحلول المخزون أقل من 0.5% من محلول M1 99 DM مع Nifedipine الذي كان يغطي العينة، ويتم استبداله بمحلول الصبغة المُحضّر. وباستخدام حجم كافٍ من الصبغة لتغطية النسيج بالكامل، يتم التحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 10 إلى 30 دقيقة بعد عملية التحضين. ثم تُغسل العينة بمحلول M1 99 M المؤكسج مع NEFE عن طريق استبدال المحتوى الكامل للحجرة.

يتم التسجيل الضوئي للنشاط العصبي في التحضيرات المحفزة كهربائياً باستخدام نظام يتكون من مجهر فلورسنت فوقي (epi fluorescence) رأسي مجهز بمقسم صور، وكاميرا عالية السرعة ذات دقة منخفضة، وكاميرا باللونين الأبيض والأسود عالية الدقة، ومولد محفزات يتم التحكم فيه بواسطة الحاسوب، ومتحكم دقيق (micromanipulator). يتم تركيب الجهاز بأكمله على طاولة عزل نشطة للاهتزازات، ومحاط بستائر صوتية ثقيلة وسقف من المايلر (Mylar) لتقليل الاهتزازات المنقولة عبر الهواء. ورغم أنه يمكن إجراء عملية الحصول على الصور من كلتا الكاميرتين باستخدام حاسوب واحد يشغل برنامجي neuro plex وGlobal Lab image two أو أي برنامج آخر للحصول على الصور، إلا أن الإعداد الموضح هنا يستخدم حاسوبين، يتحكم كل منهما في كاميرا منفصلة لبدء التجارب الضوئية.

ضع الغرفة التي تحتوي على العينة المصبوغة والمفرودة على منصة المجهر. وبما أن D four A وEPPD HQ هما صبغات غير نفاذة للغشاء ولا تومض إلا في البيئة الدهنية، فإن العصبونات السليمة في المستحضر المعوي المصبوغ يجب أن تظهر كبالونات فارغة تحت أي تكبير أعلى من 20 x عند الفحص. استخدم المرشحات HQ 5 35 50 للإثارة وHQ 5 72 LP لانبعاث الضوء ومرآة ثنائية اللون بقوة 5 65 nanometer.

بعد ذلك، وباستخدام أدوات التحكم في المجهر الدقيق (micro manipulator)، يتم وضع مصفوفة أقطاب خطية متعددة الفوهات عند الطرف الفموي للنسيج، مع التأكد من أن القطب بعيد عن عدسة المجهر الشيئية. إن المصفوفة الخطية التي تحتوي على 10 أقطاب من التنجستن موزعة على مدى سنتيمتر واحد قادرة على تحفيز عدة مسارات عصبية مستقلة، وهي مناسبة تماماً لدراسة الدوائر العقدية المترابطة. ومع ذلك، استخدمنا قطباً تحفيزياً منزلي الصنع ذو طرفين للحصول على البيانات التمثيلية.

استخدم الشمع اللاصق لوضع قطب أرضي عند الطرف المقابل من الغرفة، وقبل إجراء تسجيل وظيفي، قم بالتقاط صورة عالية الدقة وباللونين الأبيض والأسود للمنطقة التي سيتم تسجيل النشاط الكهربائي منها للمساعدة في التصوير. يمكن عكس التدرج الرمادي بحيث يظهر الفلورسنت داكناً. لتطبيق التحفيز بالتيار باستخدام مولد المحفزات الذي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر، قم أولاً ببرمجة الجهاز عن طريق اختيار الكثافة والمدة والتردد وعدد المحفزات المناسبة، بالإضافة إلى التأخير بالنسبة لبداية اكتساب البيانات الضوئية.

لضمان حدوث التحفيز ضمن حدود عملية الحصول على البيانات البصرية، قم بتهيئة مولد التحفيز كجهاز يتم التحكم فيه بواسطة neuro plex. بعد ذلك، حدد معاملات الحصول على البيانات داخل neuro plex مع تحديد معدل الإطارات، وعدد الإطارات، وكسب الكاميرا. ولتحقيق تعريف كامل لجهد الفعل، يجب ضبط معدل الإطارات على 1 kHz كحد أدنى.

بما أن D four A و E-P-P-G-H-Q يُظهران انخفاضاً في الفلورة عند إزالة الاستقطاب، وهو انخفاض يرتبط خطياً بالتغير في الجهد، فقم بعكس عرض الإشارات الضوئية داخل neuro plex بحيث لا تظهر جهود الفعل مقلوبة. ابدأ عملية الاستحواذ. تذكر استحواذ صورة جديدة عالية الدقة باللونين الأبيض والأسود لكل مجال رؤية قبل إجراء كل عملية من التسجيلات الوظيفية.

بمجرد اكتمال عملية الاستحواذ، استخدم برنامج neuro plex لتحليل النتائج دون اتصال بالإنترنت. تظهر منطقة من الشاشة تسمى عرض الصفحة (page display) الصورة الخام للعينة كما التقطتها الكاميرا عالية السرعة بدقة 80 × 80 كإطار منفرد. عندما يكون وضع الصفحة هو "الإطار المطلق" (absolute frame)، يتم تراكب الصورة عالية الدقة التي تم الحصول عليها بواسطة الكاميرا الثانية فوق خريطة بكسلات الصورة الخام باستخدام أوامر عرض neuro plex.

يتطلب ذلك تغيير وضع الصفحة من التتبع المطلق (absolute trace) إلى التتبعات (traces)، واختيار الصورة المتراكبة من ضمن أمر العرض. استخدم الفأرة لتحديد بكسلات فردية أو مجموعات من البكسلات من الصورة المعروضة في شاشة الصفحة. ستظهر مخرجات مناطق الاهتمام هذه كتتبعات داخل نافذة عرض التتبع، مما يكشف عن مقدار التغيرات البصرية التي سجلتها تلك البكسلات كدالة في الزمن.

يؤدي عكس التدرج الرمادي في الصورة عالية الدقة إلى تحسين التصوير في عرض صفحة وضع التتبع، ويُنصح بشدة بعرض مخرج تناظري من المحفز. حدد قناة المخرج التناظري لإدراجها ضمن نافذة عرض التتبع. يشير هذا المخرج إلى التوقيت الدقيق للمنبهات المطبقة أثناء التجربة.

لعرض البيانات كفيلم، استخدم أوامر الفيلم داخل neuro plex لعرض الإطارات المتتالية ضمن مجموعة البيانات باستخدام مقاييس ألوان زائفة تم ضبطها وفقاً للحدين الأقصى والأدنى للتغير في شدة الفلورة. تم تصوير عقدة عصبية من تحضير ضفيرة عضليّة مصبوغة بـ DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q باستخدام كاميرا عالية الدقة وعدسة شيئية بقوة 60 x. وأثناء عملية الحصول على البيانات، تم تحفيز التحضير بسلسلة من خمس نبضات بتردد 40 hertz.

عندما بلغت سعة كل نبضة 15 milliamps ومدتها 0.5 milliseconds، تم تحديد أربع مناطق اهتمام (ROIs) وإنشاء رسوم بيانية لعرض البيانات الضوئية المتوسطة عبر المناطق المختارة في تسلسل إطارات الألوان الزائفة؛ حيث تظهر مناطق الاستجابة الضوئية الأولى لإزالة استقطاب الغشاء، والتي تشير إلى النشاط العصبي، باللون الأصفر إلى الأحمر. وتشير هذه البيانات إلى أن النشاط الناتج عن التحفيز يحدث في مناطق منفصلة من كل عقدة عصبية، ويكون في الغالب محمولاً بواسطة المحاور العصبية المارة. وتحدد مناطق الاهتمام الثانية والثالثة والرابعة عصبونات فردية على مسافات مختلفة من منطقة الاهتمام الأولى.

يوضح الشكل الثاني بتكبير 10x المسارات التشريحية التي قد تنتشر عبرها المعلومات، وتشير الأسهم إلى الاتجاه الذي يتبعه التحفيز لتنشيط العقدة العصبية المعوية المحددة. لقد عرضنا لكم للتو مكونات إعداد بصري لتسجيل النشاط الكهربائي باستخدام الأصباغ الحساسة للجهد، وكيف يفتح تطبيق هذه التقنية على الجهاز العصبي الداخلي إمكانية دراسة الاتصال الوظيفي داخل وبين شبكتين ثدييتين سليمتين تحت مجال المجهر. عند استخدام تقنية التسجيل البصري، تكون الدقة في التفاصيل في غاية الأهمية.

يجب التحكم بدقة في مصادر الضوضاء البصرية والميكانيكية والكهربائية، كما يجب الحفاظ على سلامة التحضيرات بدقة متناهية. وبناءً على ذلك، فإن إتقان جميع الخطوات الفردية لهذا البروتوكول أمر أساسي لتحقيق النجاح في التسجيل البصري. هذا كل شيء.

شكراً جزيلاً للمشاهدة، مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.