Einzel-Zell-Saug-Recordings aus Maus Zapfen-Photorezeptoren

Dieses Video zeigt die Dissektion der Netzhaut von Mäusen und die anschließende Aufnahme von Einzelzell-Saugaufzeichnungen für Zapfen. Die Augäpfel einer euthanasierten dunkeladaptierten Maus werden im dorsalen Teil kauterisiert und unter schwachem rotem Licht entkernt. Die Augäpfel werden dann halb sektoriert.

Entlang des Äquators werden dann die Hornhaut und die ventralen Teile der Augäpfel entfernt. Die dorsale Netzhaut wird von der Pigmentepithelschicht isoliert und mit einer Rasierklinge in kleine, dünne Stücke geschnitten. Die Netzhautscheiben werden dann in die Aufnahmekammer gelegt, die auf einen Mikroskoptisch passt.

Mehrere Photorezeptorzellkörper werden in die Aufzeichnungselektrode hineingezogen. Wenn ein Zapfen-Photorezeptor in die Elektrode gezeichnet wird, induziert ein heller Testblitz eine Photoreaktion mit einer Amplitude von mehr als vier Pikoampere. Hi.Hi.Ich bin Jin vom Dr.Mir Kops Labor in der Abteilung für Augenheilkunde und der visuellen Volkszählung an der Washington University in St.Louis.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Aufzeichnung von Photoantworten von einzelnen Moscon-Photorezeptoren. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Anpassungseigenschaften von Säugetier-Cons zu untersuchen, den Photorezeptoren, die unser Tagessehen vermitteln. Also lasst uns loslegen.

Einen Tag vor der Aufnahme experimentieren Sie dunkel. Passen Sie eine Maus an, indem Sie sie über Nacht in einen lichtdichten Käfig legen. Verwenden Sie einen Mikropipettenabzieher, um Aufzeichnungselektroden aus Silikatglasröhren unter einem Verbundmikroskop herzustellen.

Verwende zum Brennen einen Heizfaden. Polieren Sie die Spitze jeder Elektrode, um sie zu glätten und ihre Öffnung auf den gewünschten Durchmesser zu reduzieren. Bei einer Einzelzellenabsaugung aus einem Mauskegel sollte die Aufzeichnung des Innendurchmessers an der Elektrodenspitze etwa sechs bis sieben Mikrometer betragen.

Bereiten Sie eine 1%ige AGRI-Lösung in destilliertem Wasser vor. Geben Sie die Lösung in kochendes Wasser, um den Agar zu schmelzen. Sobald der Agar geschmolzen ist, geben Sie ihn in eine Spritze und füllen Sie die Glaspipetten mit der Lösung.

Zur Vorbereitung der Referenzelektroden lassen Sie die Elektroden 10 Minuten bei Raumtemperatur erstarren. Nachdem der Agar erstarrt ist, schneiden Sie jede Pipette mit einem Diamantmesser in zwei Hälften, um zwei Referenzelektroden herzustellen. Legen Sie die Referenzelektroden in ein mit Referenzlösung gefülltes Szintillationsfläschchen und weichen Sie sie mindestens 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius ein, damit die Lösung in das Agargel eindringen kann.

Referenzelektroden können bis zu drei Monate ab dem Datum der Erstellung verwendet werden. Gebrauchte Elektroden werden nach dem Experiment entsorgt. Das Aufzeichnungssystem besteht aus einem inversen Mikroskop, das auf einem Luftfederungstisch montiert ist, um Vibrationen zu minimieren, und einem Käfig, der durch einen Käfig abgeschirmt ist, um elektromagnetisches Rauschen zu minimieren.

Zur Positionierung der Aufzeichnungselektrode wird ein motorisierter Mikromanipulator verwendet. Der optische Stimulator besteht aus Wolframfilament, computergesteuerten Verschlüssen und optischen Filtern zur Steuerung von Wellenlänge und Lichtintensität. Ein Patch-Clamp-Verstärker wird verwendet, um Membranströme von einzelnen Photorezeptorzellen zu detektieren.

Während der Aufnahmen wird das Gewebe perfundiert. Geben Sie einen Liter vorbereiteten Perfusionspuffer in ein 40 Grad Celsius heißes Wasserbad in der Nähe des Aufnahmesystems. Verbinden Sie dann den Perfusionspuffer mit einem Schlauch mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid, so dass er kontinuierlich Blasen wirft.

Mit Hilfe eines Photometermaßes, bei dem die ungedämpfte Lichtleistung des ungedämpften Lichts aus dem optischen Stimulator ermittelt wird, wird der Detektor des Photometers auf dem Mikroskoptisch in der Ebene platziert, in der das Präparat platziert wird. Rechnen Sie anschließend den Messwert in Mikrowatt in Photonen pro Quadrat, Mikrometer pro Sekunde um, um die Anzahl der Photonen pro Test zu schätzen. Blitz unter Berücksichtigung der Dämpfung des Lichts durch Graudichtefilter.

Sobald die ungedämpfte Lichtleistung gemessen wurde, nehmen Sie das Photometer vom Tisch und montieren Sie die Aufnahmekammer, die für die Experimente verwendet werden soll, auf dem Tisch des inversen Mikroskops. Verbinden Sie die Flasche mit der Profusionslösung über ein Regelventil mit einem Schlauch mit der Aufnahmekammer. Verlegung des Schlauches durch einen Heizwiderstand.

Stellen Sie sicher, dass der Heizwiderstand unmittelbar vor der Aufnahmekammer platziert wird. Verbinden Sie dann den Bypass-Schlauch vom Regelventil mit der Aufnahmekammer. Initiieren Sie die Profusion, indem Sie das Durchflussregelventil öffnen und auf eine Durchflussrate von einem bis 1,5 Milliliter pro Minute einstellen.

Die Profusionslösung läuft durch die Schwerkraft aus der Aufnahmekammer in einen Auffangkolben ab. Verwenden Sie eine Spritze mit einer stumpfen Nadel, um die Elektrodenhalter mit Referenzlösung zu füllen. Füllen und spülen Sie die Aufnahmeelektrode mit einer Mikrofill-Spritze mit der Referenzlösung, wobei Sie darauf achten müssen, dass sich keine Blasen in der Elektrode befinden.

Stecken Sie die Referenzelektrode in einen Elektrodenhalter und verbinden Sie sie mit dem Referenzpol des Verstärkerkopftisches. Verwenden Sie einen Gummiring, um das thermische Element an die Referenzelektrode zu binden. Stellen Sie sicher, dass die Elektrode und die thermischen Kupplungsspitzen nahe beieinander platziert werden, um sicherzustellen, dass die Temperaturmessung so nah wie möglich an der Zelle durchgeführt wird.

Setzen Sie dann die Aufnahmeelektrode in einen Elektrodenhalter ein und montieren Sie den Halter an der Kopfstufe des Verstärkers. Verbinden Sie mit einem Schlauch einen kleinen Behälter mit Mineralöl mit dem seitlichen Anschluss des Elektrodenhalters. Durch sanftes Saugen mit dem Mund durch einen Schlauch, der mit dem Reservoir verbunden ist, wird die Zelle in die Elektrode gezogen.

Öffnen Sie mit der Computersoftware einen der Verschlüsse des optischen Stimulators. Um die Strahlfläche des Testblitzes auf dem Mikroskoptisch sichtbar zu machen, fokussieren Sie das Mikroskop auf den Boden der Aufnahmekammer. Bewegen Sie die Elektrode mit dem Mikromanipulator in die Mitte des Prüfblitzstrahlbereichs.

Positionieren Sie die Referenzelektrode in der Nähe der Spitze der Aufnahmeelektrode. Stellen Sie die Spannung für die Heizung so ein, dass die Temperatur der Lösung in der Aufnahmekammer etwa 36 bis 38 Grad Celsius beträgt. Bei einem Dichtheitstest, bei dem die Spannung gemessen wird, um die Stromamplitude voreinzustellen, soll der Widerstand der Aufzeichnungselektrode normalerweise etwa 900 Kiloohm überprüft werden.

Der Dichtheitstest ermöglicht den Nachweis von Blasen in den Aufzeichnungs- oder Referenzelektroden oder einer ungeeigneten Spitzengröße der Aufzeichnungselektrode. Die Dichtheitsprüfung wird softwaregesteuert durch das Erfassungsprogramm clamp X. Der Widerstandswert wird auf dem Computerbildschirm angezeigt. Wenn der Widerstand zu niedrig ist, weniger als 500 Kiloohm, ist die Spitze der Elektrode wahrscheinlich zu groß und es muss eine neue Elektrode installiert werden.

Wenn der Widerstand höher als ein Milliohm ist, kann eine Blase in der Elektrode vorhanden sein oder ihre Spitze ist zu schmal und die Elektrode muss gespült oder ausgetauscht werden. Sobald das Aufnahmegerät einsatzbereit ist, bereiten Sie die Netzhautschnitte für das Experiment unter schwachem rotem Licht vor und verwenden Sie die Spitze der heißen Präpariernadel, um die Sklera am hintersten Punkt jedes Augapfels einer euthanasierten dunkeladaptierten Maus zu kauterisieren. Dann keimen Sie die Augäpfel mit einer Schere.

Verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um die Augäpfel in ein Präpariermikroskop zu übertragen, das mit Infrarotbeleuchtung und Infrarotbildwandlern ausgestattet ist. Alle weiteren Präpariermanipulationen werden unter Infrarotlicht durchgeführt. Schneiden Sie dann mit einer Mikroschere den Augapfel entlang des Äquators bis auf den Kauterpunkt auf.

Verwenden Sie eine scharfe Pinzette, um die Linse zu entfernen. Entfernen Sie dann so viel Glaskörper wie möglich mit der Kauterspitze als Referenz. Verwende eine Rasierklinge, um den ventralen Teil der Augenmuschel zu entfernen.

Entfernen Sie dann die Hornhaut. Als nächstes lösen Sie mit einer Pinzette die dorsale Netzhaut von der Pigmentepithelschicht. Legen Sie dann die Netzhaut-Vo-Rezeptorseite nach oben auf den Boden einer neuen Petrischale, die mit ein bis zwei Millilitern einer 10 millimolaren Glukose-Referenzlösung mit 0,1 % BSA gefüllt ist und vorsichtig auf die Netzhaut gedrückt wird, um sie mit einer Rasierklinge abzuflachen.

Schneide die Netzhaut in kleine, dünne Stücke. Inkubieren Sie dann das Präparat in einer Lichtbox, die kontinuierlich mit reinem Sauerstoff gesättigt ist, bevor Sie die Netzhautscheiben in die Aufnahmekammer geben. Schalten Sie die Heizung vorübergehend aus.

Schalten Sie den Profusionsfluss auf den Bypass-Schlauch um. Lassen Sie dann mit einem Kim-Tuch den größten Teil der Lösung aus der Kammer ab. Schalten Sie die Infrarotbeleuchtung ein.

Nehmen Sie die Retina-Suspension aus dem Inkubator und übertragen Sie die Scheiben in die Aufnahmekammer. Lassen Sie die Scheiben mit einer weit öffnenden Transferpipette zwei Minuten lang einwirken. Nachdem sich die Netzhautscheiben abgesetzt haben, schalten Sie die direkte Perfusion und die Heizung wieder ein.

Identifizieren Sie ein Stück Netzhaut, dessen äußere Photorezeptorsegmente herausragen. Positionieren Sie die Spitze der Aufzeichnungselektrode mit dem Mundsauger über der äußeren Kernschicht der Netzhaut. Ziehen Sie mehrere Photorezeptorzellkörper vorsichtig in die Elektrode hinein, wobei die Zellen in die Elektrode gezogen werden.

Geben Sie einen 20-Millisekunden-Testblitz mit 500 Nanometern. Die lichtinduzierte Änderung des Stroms, der durch den Photorezeptor fließt, stellt die Testblitzantwort dar. Ein gesunder Kegel erzeugt eine maximale Ansprechamplitude von vier bis sieben Pico, MPIs oder pa.

Bei Stimulation mit ungedämpftem Testblitz. Sobald eine gute Zelle gefunden wurde, senken Sie das Mineralölreservoir vorsichtig von Hand ab, um einen leichten Unterdruck auf die Spitze der Elektrode auszuüben, um das innere Segment der Zelle in der Elektrode zu halten. Wenn die Zelle reagiert, zeichnen Sie eine Reihe von Reaktionen auf Testblitze mit einer Intensität von Schwellenwert bis Sättigung auf.

Mit dieser Technik können wir mit Hilfe einer Saugelektrode Zapfen-Photoantworten aus Netzhautschnitten von Mäusen erhalten. Hier wird eine Überlagerung mehrerer Aufzeichnungen aus derselben Zelle angezeigt. Die Photoreaktionen eines einzelnen Zapfens wurden durch Testblitze mit zunehmender Intensität von schwach, was hier eine Schwellenreaktion von etwa einem Pico-Ampere erzeugt, bis hin zu einer hellen Intensität, die eine Sättigungsreaktion von etwa 5,5 Piko-Ampere erzeugt, induziert.

Wenn die Blitzintensität erhöht wird, nimmt die Amplitude der Photoreaktion zu, bis sie die Sättigung erreicht. Die Blitze werden gegeben, wenn die Zeit gleich Null ist. Wir zeigen Ihnen nur, wie Sie Fotoantworten von einzelnen Moscon-Photorezeptoren mit einer Saugelektrode aufzeichnen können.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, den Do-Do-Teil der Netzhaut zu erhalten, die Netzhaut in dünne Scheiben zu schneiden, die Elektrode sauber zu halten oder Blasen zu blasen und sowohl mechanische als auch elektroelektromagnetische Geräusche zu minimieren. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.