Split-Ubiquitin Basierend Membrane Yeast Two-Hybrid (Mythos) System: Ein wirksames Instrument zur Ermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Das Mythossystem basiert auf dem Konzept des gespaltenen Ubiquitins, das sich auf die Fähigkeit von Ubiquitin bezieht, stabil in endterminale und UBI- und C-terminale CUB-Hälften getrennt zu werden, die in der Lage sind, sich zu einem Pseudo-Ubiquitin-Molekül in voller Länge zu rekonstituieren. Während diese Rekonstitution bei Verwendung von Wildtyp-NUBI spontan ist, führt die Einführung einer ISIN 13 in die Glycin-Mutation durch die Produktion eines Fragments namens NUBG dessen Affinität zu CUV stark ab und blockiert somit die Bildung von pseu-Ubiquitin. Wenn NUBG und CUB mit Protein A bzw. Protein B fusioniert werden und A und B zur Interaktion fähig sind, dann kann das pseu Ubiquitin-Molekül wieder gebildet werden.

In der Mythologie werden integrale Membranköder mit einem Angriff verschmolzen, der aus dem CUB-Fragment besteht, das an einen künstlichen Transkriptionsfaktor gebunden ist. Während Lobeshymnen auf das NUBG-Fragment verschmolzen werden, führt eine Wechselwirkung zwischen Köder und Beute zur Rekonstitution des Pseudo-Ubiquitins, das wiederum an zytosolischen deubiquitinierten Enzymen in Form einer Schere zu erkennen ist. Diese Enzyme spalten sich nach dem C-Terminus von CUB und setzen den Transkriptionsfaktor frei, der dann in das Zellkern- und Aktivator-Reportersystem gelangen kann, was eine selektive Isolierung und Identifizierung von Zellen ermöglicht, in denen BA-Beuteinteraktionen auftreten.

Hallo, ich bin Janie Snyder vom Igor STAARs Lab in den Abteilungen für Molekulargenetik und Biochemie an der University of Toronto. Heute zeige ich Ihnen ein Verfahren für die Verwendung von Membranen zwei Hybriden oder Mythen, und wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Wechselwirkungen von integralen Membranproteinen zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Bevor Sie eine Mythenanalyse durchführen, stellen Sie sicher, dass Ihr Köderprotein seinen N- und/oder C-Terminus im Zytosol der Zelle hat. Der CUB Lex A VP 16 Tag muss an einem solchen Ende mit Ihrem Protein fusioniert werden. Da sich die für die Freisetzung von Transkriptionsfaktoren notwendigen deubiquitinierten Enzyme im Zytosol befinden, können Sie, wenn die Topologie Ihres Köderproteins nicht bekannt ist, Konstrukte erzeugen, die sowohl am NNC-Terminus als auch mit dem N-U-B-G-I-Kontrolltest

Entscheiden Sie als nächstes, welche der beiden Hauptvarianten des Mythos für Ihr Experiment geeignet ist. Für native Hefeproteine ist Integrated Myth oder Immy die Methode der Wahl. In Imy werden Bates endogen mit dem CUB Lex einem VP 16 Tag versehen, wodurch sie unter der Kontrolle ihres einheimischen Promoters stehen.

Dies ist vorteilhaft, da das Wildtyp-Expressionsniveau von Bates dazu beiträgt, Probleme zu beseitigen, die mit Proteinüberexpression verbunden sind, wie z. B. eine erhöhte Anzahl falsch positiver Ergebnisse für nicht-native Hefeproteine, traditionelle Mythen oder T-Mythen verwendet werden können, wobei CU B Lex A V VP 16 Tag Bait topisch von einem Plasmid überexprimiert werden. Wir werden uns in diesem Protokoll auf den T-Mythos konzentrieren, da diese Form des Mythos mit Ausnahme der anfänglichen Köderkonstruktion und der verwendeten Medien breiter anwendbar ist, werden beide Formen des Mythos im Wesentlichen auf identische Weise ausgeführt. Der Köder muss in einen geeigneten Vektor für das Tagging und die Expression geklont werden.

Eine Vielzahl von T-Mythos-Vektoren ist derzeit verfügbar, wie z. B. BV vier, p, a, BV vier und PCM BV vier, die die Konstruktion von c terminal-markierten Bates, Beit Cub Lexie, VP 16 unter der Kontrolle eines sehr starken TF eins starken A DH jeweils und schwachen CYC einem Promotor ermöglichen. Sobald der Teameffektor ausgewählt wurde, verdaut die Restriktion das Plasmid an der entsprechenden Restriktionsstelle. Die Spaltung sollte nur in unmittelbarer Nähe des Transponders CU B Lxe VP 16 vor dem Tag für die Kennzeichnung des Anschlusses C oder stromabwärts für die Kennzeichnung des Anschlusses N erfolgen.

Wenn beispielsweise der PAM-BV-Vektor verwendet wird, ist SFI one eine ideale Wahl, nachdem das Plasmid verdaut und bei minus 20 Grad Celsius gelagert wurde, bis es einsatzbereit ist, besteht der nächste Schritt darin, Primer für die Amplifikation und Klonierung des interessierenden Gens zu entwickeln. Die fünf Primzahlen Ihres vorderen Primers müssen mit etwa 35 bis 40 Nukleotiden stromaufwärts der Restriktionsstelle übereinstimmen. Während die drei Primzahlen mit den ersten 18 bis 20 Nukleotiden des Zielgens übereinstimmen müssen, das ein DRB zwei ist, das für das Beta zwei und den generischen Rezeptor kodiert.

In unserem Beispiel müssen die fünf Primzahlen des Reverse-Primers mit dem reversen Komplement von etwa 35 bis 40 Nukleotiden stromabwärts der Restriktionsstelle übereinstimmen. Mit den drei Primzahlen, die mit dem umgekehrten Komplement der letzten 18 bis 20 Nukleotide des Zielgens übereinstimmen, wobei der Stoppcode weggelassen wird, wenn das CUB Lex-Sagen VP 16-Tag am C-Terminus platziert wird, wie es im gezeigten Beispiel geschieht, abhängig davon, ob N- oder C-terminales Tagging durchgeführt wird, sicherzustellen, dass die ausgewählten 35 bis 40 Nukleotide der Plasmidsequenz, die im Vorwärts- oder Rückwärtsprimer verwendet werden, dazu führen, dass das Zielgen im Rahmen mit dem CU B Lex, einem VP 16-Tag, kloniert wird. Da in unserem Beispiel der C-Terminus des A DRB zwei Proteine markiert werden.

Die 35 Basen der A-MBV-Sequenz im reversen Primer wurden so ausgewählt, dass die A-DRB-, Zwei- und CUB-Gensequenzen innerhalb desselben Leserahmens liegen, amplifizieren das interessierende Gen durch PCR unter Verwendung der ausgewählten Primer. Die PCR-Parameter hängen von dem jeweiligen Enzym und den spezifischen Primern ab, die verwendet werden, um eine Umgebung zu schaffen, in der die homologe Rekombination der Lückenreparatur stattfinden kann. Das zuvor verdaute Plasmid und das amplifizierte Gen von Interesse werden unter Verwendung eines Standard-Hefetransformationsprotokolls, wie es von Geets und Woods beschrieben wird, in einen geeigneten Hefestamm transformiert.

Sobald die transformierte Hefe auf dem Teller gewachsen ist, wählt man eine einzelne Kolonie des Stammes aus und impft sie in fünf Milliliter SD minus Leucin. Flüssige Medien wachsen über Nacht bei 30 Grad Celsius, nachdem die Kultur über Nacht gewachsen ist und die Sättigung erreicht hat. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 700 GS pro fünf Minuten und entfernen Sie die überstehende Isolatköder-Plasma-DNA aus dem Zellpellet mit einem handelsüblichen Mini-Vorbereitungskit.

Befolgen Sie das Standardprotokoll mit einer Modifikation, um eine ausreichende Lyse der Hefezellen bei einem kleinen Volumen von 0,5 Millimolar zu gewährleisten. Kalknatronglasperlen werden nach der anfänglichen Wiederbelebungssuspension auf das Pellet aufgetragen und fünf Minuten lang kräftig vortext. Fahren Sie dann wie gewohnt mit dem kommerziellen Protokoll fort. Transformieren Sie isolierte Hefe-DNA in einen chemisch kompetenten E-Coli-Stamm, der für die Plasmidvermehrung mit einer Transformationseffizienz von mindestens eins mal 10 Zellen pro Mikrogramm DNA geeignet ist.

Nach der Ernte der Plasma-DNA aus den transformierten E-coli ist die korrekte Konstruktion des Köderplasmids durch Sequenzierung vor der Verwendung zu überprüfen. Die Köderstämme müssen analysiert werden, um sicherzustellen, dass die Köderproteine ordnungsgemäß an der Hefemembran lokalisiert sind. Die Lokalisation wird mittels Fluoreszenzmikroskopie bestimmt. Die Aufnahme eines A-YFP-Moleküls in die Köder-Tag-Sequenz ermöglicht die direkte Visualisierung lebender Zellen und wird häufig in imy verwendet.

Alternativ kann ein Standard-Immunfluoreszenzansatz unter Verwendung von Antikörpern gegen die Lex A- oder VP 16-Komponenten des Tags verwendet werden, nachdem die richtige Lokalisierung des Köders etabliert wurde. Es ist notwendig, sicherzustellen, dass der Köder nicht selbstaktivierend ist, er aktiviert das Reportersystem nicht allein oder in Gegenwart von nicht interagierendem Lob, um sicherzustellen, dass der Köder nicht selbstaktivierend ist, verwenden wir den N-U-B-G-I-Test. In diesem Test.

Der Köder wird mit interagierenden positiven und nicht interagierenden negativen Kontrolllob transformiert, und dann werden verschiedene Verdünnungen jedes Transformanten auf geeigneten selektiven Medien gesichtet. Abat muss auf selektiven Medien in Gegenwart der Positivkontrolle wachsen und wächst nicht in Gegenwart der Negativkontrolle, um für die Verwendung in Mythen geeignet zu sein. Sobald der Köder validiert wurde, kann der Mythenreporterstamm, der den Köder enthält, mit einer Beutebibliothek von Interesse transformiert werden, um nach Protein-Protein-Wechselwirkungen zu suchen.

Um diese groß angelegte Hefeumwandlung zu beginnen, impfen Sie eine einzelne Kolonie des Mythenreporterstammes, die Ihren Köder enthält, in fünf Milliliter SD minus Leucinmedium und inkubieren Sie über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Schütteln. Die Übernachtkultur wird in 200 Milliliter SD minus Leucinmedium verdünnt und bei 30 Grad Celsius unter Schütteln inkubiert, bis ein OD 600 von 0,6 bis 0,7 erreicht ist. Wenn der angestrebte OD 600 erreicht ist, teilen Sie die 200-Milliliter-Kultur auf vier 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss auf und ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Nach dem Waschen der Pellets mit sterilem, doppelt destilliertem Wasser und Lithiumacetat-Trissy DTA-Lösung suspendieren wir jedes Pellet in 600 Mikrolitern Lithiumacetat-Trissy DTA-Lösung in jedem der vier 15-Milliliter-Schraubenzentrifugenröhrchen. Fügen Sie 2,5 Milliliter PEG-Lithiumacetatlösung, zwei 600 Mikroliter resuspendierte Zellen, 100 Mikroliter Lachsspermien-DNA-Lösung und sieben Mikrogramm Beutebibliotheks-DNA vier hinzu. Texten Sie die Röhrchen eine Minute lang, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten, und inkubieren Sie sie dann 45 Minuten lang in einem 30 Grad Celsius warmen Wasserbad.

Nach der 45-minütigen Inkubation alle 15 Minuten kurz mischen. Geben Sie 160 Mikroliter Dimethylsulfoxid oder DMSO in jedes Röhrchen und mischen Sie sofort, indem Sie die Röhrchen umdrehen. In einem 42 Grad Celsius warmen Wasserbad 20 Minuten lang inkubieren.

Wenn der Hitzeschock abgeschlossen ist, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und Reanimation. Suspendieren Sie jedes der Pellets in drei Millilitern von zwei X-Y-P-A-D. Ziehen Sie alle Proben zusammen in ein einzelnes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss.

Inkubieren Sie die Zellen 90 Minuten lang bei 30 Grad Celsius für die Zellregeneration. Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie das Zellpellet in 4,9 Millilitern sterilem 0,9%igem Natriumchlorid unter Verwendung von 100 Mikrolitern resuspendierten Zellen. Bereiten Sie eine zehnfache serielle Verdünnung in sterilem 0,9%igem Natriumchlorid im Bereich von 10 x bis 10.000 x Platte, 100 Mikroliter der 100 x und 1000 x Verdünnung auf selektive Medien vor und inkubieren Sie sie zwei bis drei Tage lang bei 30 Grad Celsius.

Diese Platten dienen als Kontrolle und werden verwendet, um den Wirkungsgrad der Transformation gleichermaßen zu berechnen. Die restlichen 4,8 Milliliter der resuspendierten Zellen und der Platte auf große 150-Millimeter-Platten aufteilen und drei bis vier Tage bei 30 Grad Celsius inkubieren. Sobald die Kolonien gewachsen sind, werden einzelne Kolonien, die jeweils Zellen repräsentieren, die ein potenziell interagierendes Köder-Beutepaar in 100 Mikrolitern 0,9 % Natriumchlorid enthalten, durch die Wiederbelebung unterbrochen und fünf Mikroliter-Aliquote in selektive Medien mit XG umgewandelt, so dass sie nur zwei bis vier Tage lang wachsen können.

Kolonien, die ein robustes Wachstum und eine blaue Farbe aufweisen, werden für die weitere Analyse ausgewählt. Nachdem Sie die Plasmide aus den positiven Hefekolonien isoliert und sequenziert haben, kompilieren und analysieren Sie alle Sequenzierungsdaten, um Ihre vorläufige Liste von Interaktoren zusammenzustellen. Um diese Wechselwirkungen erneut zu überprüfen, wird der Köderabhängigkeitstest eingesetzt.

In diesem Test werden alle Beuteplasmen, die die identifizierten Interaktoren exprimieren, wieder in den ursprünglichen Köderstamm transformiert, sowie in den Stamm, der einen künstlichen Kontrollköder beherbergt, der aus einer einzelnen Transmembrandomäne besteht, die mit dem CUB Lex fusioniert ist, einem VP 16-Tag, resuspendieren einzelne Kolonien aus diesen Umwandlungen in 100 Mikrolitern sterilem, doppelt destilliertem Wasser und lokalisieren fünf Mikrolitervolumina unter dem entsprechenden selektiven Medium plus X sc. Für jede Beute sollten mehrere Transformanten ausgewählt werden, und sowohl der Originalköder als auch der Kunstköder sollten auf derselben Platte gesichtet werden. Inkubieren Sie die Platten für zwei bis vier Tage bei 30 Grad Celsius. Hefe, die den künstlichen Köder in Beutetieren trägt, die die Aktivierung des Reportersystems verursachen, gelten als promiskuitiv und diese spezifische Beute wird von der Liste der Interaktoren entfernt.

Lob, das Wachstum und Blaufärbung der Hefe mit dem Köder von Interesse verursacht, aber nicht mit dem künstlichen Köder. Bestätigen Sie eine bestimmte Interaktion. Wenn jedoch die Hefe, die die Beute beherbergt, und Ihr Köder von Interesse nicht wachsen.

Diese Beute wird aus der Liste der Interaktoren entfernt. Das verbleibende Lob stellt die vollständige Liste der Interaktoren dar, die auf dem Mythos-Bildschirm identifiziert wurden. Nach Abschluss des Mythosverfahrens verfügen Sie über eine Interact Home-Karte.

Dabei handelt es sich um eine Sammlung von Kandidateninteraktionen, die der Forscher anhand spezifischer Studien, die von Fall zu Fall ermittelt werden, weiter analysieren muss. Um die biologische Bedeutung jedes einzelnen zu beurteilen, haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie das Membran E zwei Hybrid- oder Mythosverfahren durchführen, um die Interaktionspartner eines Proteins von Interesse zu identifizieren. Bei der Durchführung des Mythosverfahrens ist es wichtig zu überprüfen, ob sich das Ende und/oder der C-Terminus Ihres Be of Interest im cito der Zelle befindet, und Ihre Tagging-Strategie entsprechend zu gestalten.

Darüber hinaus ist es wichtig, sorgfältig zu prüfen, ob Ihre Köderstämme den Köder richtig ausdrücken und ob der Köder richtig lokalisiert ist. Darüber hinaus ist es wichtig, den NUB-GI-Kontrolltest durchzuführen, da dies nützlich ist, um die Screening-Bedingungen festzulegen. Stellen Sie schließlich sicher, dass Sie alle Interaktionen, die Sie mithilfe von Mythen feststellen, unabhängig überprüfen.

Wenn Sie diese einfachen Schritte befolgen, sollten Sie sicherstellen, dass Sie die bestmöglichen Ergebnisse aus dem Mythosverfahren erzielen. Nun, das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.