دراسة تجمعات الحويصلة متشابك من الأصباغ باستخدام Photoconversion Styryl

يوضح هذا الفيديو إجراء التحويل الضوئي لصبغة Styro Dye FM 1 43. لدراسة مجمعات الحويصلات المشبكية في ذبابة Drosophila melanogaster، يتم أولاً تشريح يرقات Drosophila للكشف عن العضلات البطنية التي تشكل تحضير الوصلة العصبية العضلية (NMJ). يتم تحضين التحضيرات في محلول منظم يحتوي على FM D، والموضح هنا باللون الرمادي، والذي يعمل على وسم الغشاء الخلوي.

بعد ذلك، يتم تحفيزها كهربائيًا أو كيميائيًا لإحداث اندماج فيزيائي، حيث يتم استيعاب غشاء الحويصلة داخليًا فيما يلي. سيتم صبغ عملية الإخراج الخلوي المحفزة باستخدام صبغة FM D. ثم تُغسل صبغة FM خارج الخلوية، مما يزيلها من الغشاء البلازمي، ويتم تثبيت النسيج تحت إضاءة عالية الكثافة ومستمرة. يتم تبييض الصبغة تماماً ويظهر اللون الأسود نتيجة ترسب ثنائي أمينو بنزيدين.

يمكن بعد ذلك رؤية هذا الراسب بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (transmission EM). مرحباً، أنا فيليب أوباسو من مختبر سيلفيا أولي في المعهد الأوروبي لعلوم الأعصاب في غاتينغن، ألمانيا. سنعرض لكم اليوم إجراءً للتحويل الضوئي لـ FM في الوصلات العصبية العضلية.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة إعادة تدوير الحويصلات التشابكية. حسنًا، لنبدأ العمل تحت مجهر تشريحي. ابدأ بتثبيت يرقات drosophila بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى في طبق مغطى بمادة so guard.

قم بتغطيتها بمحلول ملحي لذبابة الدروزوفيلا باستخدام إبرة حقنة، ثم استخدم مقص التشريح لشق الجانب الظهري طولياً. بعد ذلك، قم بإزالة الأعضاء الداخلية. ثم قم ببسط العينة وتثبيتها مجدداً بالدبابيس في طبق سجار.

يمكن بعد ذلك استخدام العديد من العضلات البطنية لحماية صبغات FM المستخدمة في هذا الإجراء من البهتان. يجب تنفيذ هذا الإجراء تحت ظروف إضاءة منخفضة. قم بتغطية تحضير ذبابة الدروزوفيلا المثبتة بمحلول ملحي للدروزوفيلا يحتوي على 90 millimolar من كلوريد البوتاسيوم و 10 micromolar من FM.1 43 لتحفيز الأعصاب كيميائياً.

يُحضن العينة لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة بعد التحفيز. يتم إزالة محلول التحفيز وغمر الطبق الذي يحتوي على ذبابة Drosophila المثبتة في بيكر مملوء بـ 100 milliliters من محلول Drosophila الملحى مرتين لإزالة صبغة FM 1 43 خارج الخلوية، وذلك أثناء العمل تحت غطاء السلامة الكيميائية.

قم بتثبيت تحضير الوصلة العصبية العضلية في 2.5% glutaraldehyde في محلول ملحي منظم بالفوسفات أو PBS لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل التحضير مرة واحدة باستخدام PBS، ثم أخرجه من طبق السيجار واغمسه في 100 millimolar من كلوريد الأمونيوم لمدة 15 دقيقة؛ وذلك لإخماد مجموعات الألدهيد الحرة للمثبت glute aldehyde المتبقي.

باستخدام محلول PBS العادي، اغسل محلول كلوريد الأمونيوم، ثم ضع تحضير الوصلة العصبية العضلية في طبق سيجار جديد واغمره في محلول Diamine benzine أو DAB بتركيز 1.5 milligram per milliliter المفلتر في PBS، ثم اتركه في الحضنة لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة أربع degrees Celsius. ضع العينة تحت مجهر فلوري مجهز بمصدر ضوئي من مصباح زئبقي مع غلاف مصباح يحتوي على مرآة خلفية باستخدام عدسة شيئية جافة ذات تكبير منخفض نسبياً.

حدد موقع العينة. ثم باستخدام مكعب مرشح إثارة أزرق ووميض أخضر عادي، قم بضبط تركيز الإشارة الفلورية. تظهر الوصلات العصبية العضلية كنقاط مضيئة على العضلات.

بعد ذلك، وباستخدام مجموعة مرشحات الفلورة نفسها، قم بإضاءة العينة بأقصى شدة حتى يتم تبييض FM D تماماً. عند استخدام عدسة شيئية 20x، تكون فترة 30 إلى 45 دقيقة كافية. ومع ذلك، فإن وقت التحويل الضوئي يختلف اعتماداً على شدة الإضاءة، وقوة تغلغل DAB في التحضير، والعدسة الشيئية المستخدمة.

بعد الإضاءة، افحص العينة باستخدام الضوء النافذ. في حال حدوث التحول الضوئي، ينبغي أن يظهر راسب بني داكن. عُد إلى مجهر التشريح، ثم استخدم المقص لقص البقعة التي حدث فيها التحول الضوئي من اليرقة.

عُد إلى مجهر التشريح، ثم استخدم المقص لقص المنطقة التي تم تحديدها من خلال الصورة من اليرقات. الآن، ضع العينة في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على PBS، مع العمل تحت غطاء سلامة كيميائي وارتداء معدات السلامة المناسبة، بما في ذلك القفازات وواقي العينين.

قم بتحضير 300 µL من رباعي أكسيد الأوزميوم بتركيز 1% لكل عينة. الآن، ضع العينة في دورق زجاجي بغطاء بلاستيكي وأضف محلول رباعي أكسيد الأوزميوم المُحضّر لتثبيت العينة. وبينما تخضع العينة للحضانة، قم بتحضير محاليل منفصلة تحتوي على إيثانول بتركيزات 30% و50% و70% و90% و95% و100%.

اغسل العينة من أربع إلى خمس مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق في كل مرة. وبعد كل غسلة، استخدم رؤوس ماصات بلاستيكية (PEs) لنقل العينة إلى دورق جديد. وبعد الغسلة الأخيرة، انقل العينة إلى دورق زجاجي نظيف.

بعد ذلك، قم بتجفيف العينة عن طريق وضعها في سلسلة من محاليل الإيثانول. ابدأ بالتحضين في 1 mL من الإيثانول بتركيز 30%. ثم بعد مرور خمس دقائق، قم بإزالة الإيثانول باستخدام ماصة باستور واستبدله بـ 1 mL من الإيثانول بتركيز 50%.

استمر في عملية نزع الماء، مع تحضين تحضير الوصلة العصبية العضلية في محاليل بتركيز 70 و90 ثم 95%. بعد ذلك، يتم تحضين العينة في محلول إيثانول بتركيز 95% لمرتين، ثم في إيثانول بتركيز 100% ثلاث مرات بعد نزع الماء. أضف 2 mL من راتنج EIN بنسبة واحد إلى واحد إلى الإيثانول، وضع العينة في حاضنة دوارة.

يُترك لمدة ساعتين إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة بعد التدوير بنسبة 100%ein، وتوضع العينة في دورق مفتوح للسماح للإيثانول المتبقي بالتبخر لمدة تتراوح من أربع إلى ست ساعات. يُصب EIN حديث التحضير في قالب، ثم تضاف التحضيرات وتُحضن عند درجة حرارة 60 °C لمدة 36 ساعة.

عندما تصبح تحضيرات EIN المدمجة جاهزة، استخدم جهاز التقطيع فائق الدقة (ultra microtome) لإعداد مقاطع رقيقة تتراوح سماكتها بين 50 و 80 nanometer باستخدام سكين ماسية. يتم تقطيع العينات إلى مقاطع رقيقة، حيث تطفو هذه المقاطع على الحمام المائي الخاص بالسكين، ويمكن بعد ذلك التقاطها ووضعها على شبكات EM العادية.

أصبحت التحضيرات الآن جاهزة للتصوير باستخدام إجراءات المجهر الإلكتروني التقليدية. تم تحفيز الوصلات العصبية العضلية المعزولة من Drosophila Melan gaster باستخدام البوتاسيوم عالي التركيز، وتم صبغ الأغشية الممتصة داخلياً باستخدام FM 1 43 كما هو موضح هنا.

يمكن ملاحظة الفلورة في النهاية العصبية باستخدام مجهر فلوري تقليدي (epi fluorescence microscope). وتحت الإضاءة المستمرة، يتم سحب لون الصبغة بالكامل (bleaching)، ومع استمرار الإضاءة، يظهر لون أسود نتيجة ترسيب الدينوبنزين. تحتوي هذه النهاية العصبية على حويصلات تشابكية، ولكن لم يتم تحويل أي منها ضوئيًا.

قد يكون هذا ناتجاً عن عدم كفاية الإضاءة أو ضعف تغلغل DIA amino benzine في النسيج. وفي المقابل، تؤدي الإضاءة المفرطة إلى ظهور الطرف بشكل داكن تماماً حيث لا يمكن تمييز الحويصلات أو العضيات؛ بينما يمكن رؤية التحول الضوئي عند توفر كمية الإضاءة المناسبة. تُظهر هذه الصورة المجهرية زرّاً مشبكياً تظهر فيه مجموعة من الحويصلات الداكنة، مما يشير إلى التحول الضوئي لـ FM.

لقد أظهرنا لكم للتو كيفية التحويل الضوئي للحويصلات المشبكية المسمومة بصبغة fem. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر ضرورة معايرة أوقات الإضاءة لخطوة التحويل بدقة دائمًا. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة. حظاً موفقاً في تجاربكم.