Etichettatura fluorescente di COS-7 Esprimendo SNAP-tag proteine ​​di fusione per l'imaging cellulare dal vivo

SNAP e tag clip. I sistemi di marcatura delle proteine consentono l'attacco covalente specifico di praticamente qualsiasi molecola a una proteina di interesse. Il gene di interesse può essere clonato nel vettore su entrambi i lati del tag, l'espressione del gene clonato si traduce in una proteina di fusione tag SNAP.

Il substrato dello snap tag è costituito da due parti, il benzo guin, che si riconosce dallo snap tag e il gruppo funzionale. Il gruppo funzionale può essere biotina, una perlina o un gruppo fluorescente, disponibili in una varietà di colori. Durante la reazione di marcatura, il gruppo benzo sostituito si attacca in modo covalente al tag SNAP rilasciando guanina se un Fluora four è accoppiato alla proteina desiderata, il marcatore diventa fluorescente consentendo la visualizzazione della proteina in cellule viventi o fisse.

Ciao, sono Chris Provost dei New England Bile Labs. Oggi vi mostreremo una procedura per l'imaging fluorescente di sette cellule COS vive che esprimono proteine di fusione snap tag. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare dove sono localizzate le proteine nelle cellule.

Quindi iniziamo Per preparare sette cellule per la tripsina di trasfezione, ghiacciarle secondo i protocolli standard e aggiungere da 50 a 100 microlitri di cellule a sei millilitri di terreno DMEM completo. Miscelare la sospensione cellulare pipettando più volte verso l'alto e verso il basso. Quindi aliquotare 300 microlitri di tryps in sospensione cellulare inizzata in ciascun pozzetto di una tecnologia di laboratorio sterile a otto camere, due vetri di copertura a camera incubano i campioni a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica durante la notte del giorno successivo.

Controllare la densità e la salute delle celle nelle camere di coltura cellulare. Etichettare il numero appropriato di provette per microfusi per le miscele complesse di trasfezione. In cappa a flusso laminare.

Impostare le miscele complesse di trasfezione per ogni reazione. Utilizzare 0,3 microgrammi di DNA plasma per fusione a scatto diluito in terreno privo di siero e un microlitro. Ciascuno dei plasmidi di controllo dei reagenti di trasfezione TPA D due e TPA v è disponibile per il test dell'efficacia dei reagenti di trasfezione.

Si consiglia inoltre di includere un campione finto trasfettato e/o un campione non resecato come controlli negativi per ogni miscela complessa. Innanzitutto, mescola il DMEM libero dal siero con il DNA plasmatico appropriato. Quindi aggiungere il reagente di trasfezione TPAs D two, seguito dal reagente di trasfezione TPAs v.

Mescolare bene i componenti pipettando delicatamente su e giù più volte dopo l'aggiunta di ciascun reagente e incubare le reazioni a temperatura ambiente per 30 minuti durante l'incubazione, lavare le celle una volta con 600 microlitri di DMEM completo e aggiungere 450 microlitri di DMEM completo a ciascun campione. Al termine dell'incubazione, aggiungere 50 microlitri della miscela del complesso di trasfezione a ciascun campione lentamente e goccia a goccia. Incubare i campioni per una notte a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica.

Il giorno dopo. Il costo trasfettato sette cellule possono essere etichettate con il substrato a stella TMR della cella a scatto per iniziare questa procedura a 50 microlitri di DMSO nella cella a scatto, nel substrato a stella TMR e nella pipetta su e giù mescolate mediante vortice per un minuto. Successivamente, rimuovere con cura il terreno complesso di trasfezione da ciascun campione mediante celle di lavaggio ad aspirazione sottovuoto due volte con 600 microlitri di DMEM completo.

Quindi sostituire il terreno in ogni pozzetto con 600 microlitri di DMEM completo. Riportare i campioni nell'incubatore. Miscelare i mezzi di etichettatura D aggiungendo 995 microlitri di DMEM completo e cinque microlitri di 0,6 millimolari.

Spingere la cella TMR a stella del substrato a pompare la pipetta più volte verso l'alto e verso il basso per miscelarla dopo l'aggiunta del substrato. La concentrazione finale di cellule a scatto TMR STAR deve essere di tre micromolari Rimuovere con cura i terreni di crescita dai campioni e aggiungere 200 microlitri di mezzi di marcatura DIA a ciascun pozzetto Incubare i campioni a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 30 minuti. È in questa fase che il gruppo Benzel sul substrato TMR si collegherà in modo covalente allo snap tag e rilascerà quain mentre i campioni sono in incubazione.

Preparare la soluzione HX per la colorazione nucleare dei campioni. Mescolare un microlitro di HSED 3 33 42 Tri Cloridrato TRI in 10 millilitri di DMEM completo Al termine dell'incubazione. Rimuovere il mezzo di marcatura d da tutti i campioni e a 600 microlitri di soluzione uncinata diluita per ciascun campione.

Incubare i campioni a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per cinque minuti. Dopo cinque minuti, rimuovere la soluzione uncinata diluita da ciascun campione e lavare i campioni tre volte con 600 microlitri di DMEM completo. Dopo il lavaggio finale, aggiungere 600 microlitri di DMEM completo a ciascun campione.

Incubare i campioni a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per altri 30 minuti per consentire al fluor non incorporato di diffondersi fuori dalle cellule, necessario per la marcatura intracellulare. Dopo 30 minuti, sostituire un'ultima volta il terreno sui campioni di cella a scatto con 600 microlitri di DMEM completo. Le cellule sono ora pronte per l'imaging con un microscopio a fluorescenza zeis AOME vert 200 M.

Di seguito sono riportati alcuni risultati rappresentativi dell'imaging fluorescente utilizzando la microscopia fluorescente standard di cellule CO sette vive che esprimono fusioni di tag. Questa prima immagine mostra sette cellule vive di COS che esprimono PNAP H due B marcate con la stella TMR a celle a scatto. Il costrutto pnap H two B è stato generato utilizzando il vettore M di PNAP TAG.

Le cellule sono state marcate con stella TMR a cellula a scatto per 30 minuti e controcolorazione con ganci a 3 33 42 per i nuclei. La fluorescenza rosa dimostra la sovrapposizione della fluorescenza rossa dove è presente la proteina istonica. Oltre alla fluorescenza blu che indica il nucleo, l'espressione della proteina H due B è chiaramente e facilmente identificabile.

Queste due immagini successive mostrano il costo vivo di sette cellule trasfettate transitoriamente con pnap. A due cellule DR beta sono state marcate con snap cell, tmr, stella e controcolorazione con HUX 3 33 42. Il costrutto pnap A DR beta two è stato generato utilizzando il vettore PNAP TAG M.

Le cellule sono state marcate con la stella TMR a cellule a scatto per 30 minuti e controcolorate con ganci 3, 33, 42 per i nuclei. La fluorescenza rossa indica la presenza della proteina recettore della superficie cellulare A DR beta due mentre la fluorescenza blu identifica il nucleo. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire l'imaging fluorescente di sette cellule vive della tosse che esprimono proteine di fusione snap tag.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di aggiungere il complesso di trasfezione lentamente e goccia a goccia e di conservare il substrato dello snap tag a meno 20 gradi Celsius al buio quando non è in uso. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.