Svømning-induceret lammelse (SWIP) Assay: En metode til at kvantificere dopamin-medieret bevægelse i C. elegans

- For at udføre svømme-induced lammelse, eller SWIP assay, overføre L4 iscenesatTE C. elegans larver til et glas spot plade fyldt med væske. Identificere L4 hermafrodit ved tilstedeværelsen af den udviklende vulva. En halvmåne-formet plaster i midten af kroppen, og en pisk-lignende hale.

For at vurdere dopamin-medieret svømning, registrere ormens bevægelse karakteriseret ved C-formet krop bøjning og prygl adfærd. Normalt dopaminergiske neuroner frigive dopamin i synaptisk kløft, som igen binder dopamin receptorer på den modtagende celle.

Når beskeden er videregivet, frigives dopamin fra receptorerne, og ubundne neurotransmittere kan tages op af den dopaminergiske neuron gennem specialiserede transportproteiner og genbruges.

I larver med ændret dopamin signalering, forårsaget af inaktivering mutationer i dopamin transportøren eller narkotika behandlinger, der øger dopamin frigivelse, dopamin ophobes i synaptisk kløft. Overskydende dopamin over stimulerer dopamin receptorer forstyrre motorprogrammet og forlader larverne lammet. Larver, der ikke er i stand til at bevæge sig vil synke til bunden af pladen.

I eksempelprotokollen vil vi se detaljerede demonstrationer af manuelle og automatiserede SWIP-assays i C. elegans behandlet med amfetamin.

- Til manuel vurdering af SWIP tilsættes 40 mikroliter kontrolopløsning med eller uden 0,5-millimolar amfetamin i en glaspletplade.

Start timeren. Bemærk antallet af orme, der frigives i brønden, og observere og registrere antallet af orme, der udviser SWIP ved hvert minutmærke i i alt 10 minutter.

I slutningen af proceduren skal du kopiere de rå data til et regneark og beregne procentdelen af orme, der er lammet, ved at dividere antallet af orme, der er lammet hvert minut, med det samlede antal orme, der er testet i hele analysen, og gange med 100. Kopier procentværdierne til graf- og statistiksoftware, og plot dataene med procentværdier for SWIP på y-aksen og tid på x-aksen ved hjælp af xy-grafformatet.

Statistisk analyse blandt kontrol- og amfetaminbehandlede grupper og behandlingstidspunktet kan f.eks.

For automatiseret analyse af svømning induceret lammelse, der er nedsat kameraet, orm tracker software, og script til at køre tracking software analyse. Og bruge en øjenvipper pick til at placere en enkelt sene fase L4 orm i et glas spot plade som vist tidligere.

Optag derefter svømmevideoer af en orm ad gangen, og brug ormen tracker software til at beregne hyppigheden af kroppen bøjninger. Efter scriptet forsynet med tracking software til at opnå ormen prygl frekvens og til at generere varme kort fra ormen prygl data.