Saggio di formazione di colonie di cheratinociti: un test in vitro per valutare la capacità dei cheratinociti di crescere in colonie

- Il saggio di formazione delle colonie determina la capacità delle singole cellule di proliferare e formare colonie. Inizia con una pelle dorsale di topo asportata in una piastra di coltura. Raschiare via il tessuto sottocutaneo e il grasso dal lato ventrale della pelle. Trattare il tessuto con una soluzione digestiva. Gli enzimi proteolitici nella soluzione degradano la matrice extracellulare, inducendo la dissociazione delle cellule epidermiche.

Raschiare delicatamente lo strato epidermico per rilasciare le cellule e i peli dissociati in un terreno di raccolta. Filtrare la sospensione attraverso un colino appropriato per intrappolare peli o eventuali detriti e ottenere una sospensione unicellulare di cellule epidermiche. Trasferire il volume desiderato di questa sospensione cellulare in una piastra rivestita di collagene contenente uno strato aderente di cellule alimentatrici arrestate dalla crescita. Integrare con un terreno adatto che favorisca la sopravvivenza dei cheratinociti.

Durante la coltura, i cheratinociti si attaccano allo strato di alimentazione. Inoltre, queste cellule alimentatrici secernono fattori di crescita e sintetizzano proteine della matrice extracellulare che supportano la crescita dei cheratinociti. A seconda della capacità proliferativa dei singoli cheratinociti, iniziano a formare colonie. Rimuovi il supporto e fissa le colonie. Colorare le cellule con un colorante adatto per rilevare le colonie per il conteggio. Nel seguente protocollo, eseguiremo il saggio clonogenico dei cheratinociti primari raccolti dai topi adulti dopo il trattamento con composti di prova.

- Dopo aver raccolto campioni di pelle dorsale da topi adulti soppressi, utilizzare una pinza autoclavata e un bisturi per posizionare una pelle dorsale alla volta, con il lato peloso rivolto verso il basso, in una sottile capsula di Petri e raschiare via il tessuto sottocutaneo, compreso il grasso dal lato ventrale del tessuto cutaneo, fino a quando il tessuto non è semi-traslucido.

Metti questa pelle raschiata nella PBS fino a quando tutte le altre pelli rimanenti non vengono lavorate. Quindi, usa un bisturi per tagliare i campioni di pelle in strisce da 0,5 x 1 a 1,5 centimetri. Posizionare le strisce con il pelo rivolto verso l'alto in una capsula di Petri sterile prima di far galleggiare i campioni con il pelo rivolto verso l'alto sulla superficie di una PBS da 20 millilitri più 2 volte una soluzione di gentamicina integrata con tripsina allo 0,25% in una piastra di Petri di plastica da 100 x 20 millimetri per 2 ore a 32 gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, posizionare una piastra di Petri quadrata di plastica sterile contenente 15 millilitri di terreno di raccolta con un'inclinazione di 30 gradi e utilizzare una pinza curva per trasferire con cura una striscia di pelle galleggiante nella capsula. Tenendo una nuova lama di bisturi ad un angolo perpendicolare alla pelle e usando una forza sufficiente ma non eccessiva, raschiare via l'epidermide e i peli dal campione nel mezzo.

Quando tutte le strisce sono state raschiate, decantare accuratamente il surnatante contenente cellule epidermiche in un barattolo sterile da 60 millilitri contenente un'ancoretta magnetica da 1,5 pollici e sciacquare la capsula di Petri con ulteriore terreno di raccolta per raccogliere eventuali cellule epidermiche rimanenti.

Portare il volume finale nel barattolo a 30 millilitri con terreno fresco e mescolare la soluzione di cellule epidermiche a 100 rotazioni al minuto per 20 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione con agitazione, in una cappa di biosicurezza, rimuovere l'ancoretta e filtrare la soluzione cellulare attraverso un colino da 70 micrometri in una provetta conica da 50 millilitri.

Utilizzare una pinza e poi una pipetta per premere i peli e i materiali dello strato corneo attraverso il colino per manipolare il tessuto per rilasciare le cellule ciliate intrappolate e utilizzare altri 5 millilitri di terreno di raccolta per rilasciare le cellule ciliate intrappolate rimaste nel tubo.

- È fondamentale che le cellule epidermiche e i peli vengano manipolati in modo da rilasciare le cellule dai follicoli piliferi.

- Portare il volume totale nella provetta fino a 50 millilitri con terreno fresco e raccogliere il filtrato cellulare mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in 5 millilitri di terreno di raccolta fresco e circa 20 triturazioni con una pipetta da 5 millilitri. Prelevare 0,5 millilitri della diluizione 1:20 e trasferirli in una provetta per microfuge da 2 millilitri.

Dopo aver mescolato accuratamente il campione, prelevare 200 microlitri dalla provetta per microfuge e mescolare delicatamente con un volume uguale di soluzione di Trypan Blue allo 0,4%. Mescolare delicatamente questa soluzione tre volte e trasferire le cellule in un ematocitometro per contare i cheratinociti nucleati.

Assegna un punteggio a tutte le cellule blu scuro come cellule non vitali e a tutte le piccole cellule rosate dorate come cellule vitali. La vitalità è in media di circa l'80% e la resa finale di cheratinociti per topo dovrebbe essere di circa 30 milioni di cellule vitali. Dopo il conteggio, raccogliere le cellule con un'altra centrifugazione e, per la coltura di massa, risospendere da 2 a 4 volte 10 al sesto cheratinociti vitali per piastra di Petri da 35 millimetri in 2 millilitri di terreno di coltura cellulare.

Per un saggio di formazione di colonie clonogeniche, risospendere le cellule a una dose di 1 x 10 al terzo cheratinocita per 4 millilitri di terreno E di William modificato con integratori e concentrazione sierica per piastra di Petri da 60 millimetri rivestita di collagene su strati di alimentazione 3T3 di topo svizzero irradiati a raggi X.

Per la coltura di massa, coltivare le colture a 32 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per il periodo di coltura cellulare appropriato, cambiando il terreno 24 ore dopo la semina iniziale per la coltura di massa e successivamente 3 volte a settimana.

Al termine della coltura clonale, aspirare il terreno e fissare le colonie in formalina tamponata al 10% per una notte a temperatura ambiente. La mattina successiva, colorare le colonie con lo 0,5% di rodamina B in acqua autoclavata per un'ora prima di sciacquare i piatti in acqua fredda autoclavata fino a quando l'acqua non diventa limpida. Quindi, inclinare i piatti sui coperchi ad asciugare prima di contare le colonie.