Oligo perfiles Misa (OLIMP) de polisacáridos extracelulares

El perfil de masa de oligonucleótidos o el experimento olímpico que se muestra aquí permite obtener una visión rápida de la estructura de los polímeros en la matriz extracelular o la pared celular de un organismo. En el caso que nos ocupa, las paredes celulares se preparan a partir de plántulas de plantas eliminando primero los componentes celulares con etanol al 70%. A continuación, el polímero de la pared objetivo se digiere con un hidroencaje específico que solubiliza componentes particulares de la pared en forma de ligamentos.

Un enfoque alternativo es digerir la pared celular con la enzima C dos directamente sobre el tejido. La abundancia relativa de los ligamentos de liberación se determina mediante MALDI mediante espectrometría de masas y análisis estadístico. Hola, soy Marcus Polly del Instituto de Biociencias de la Energía de la Universidad de California en Berkeley.

Hola, soy Marcus Re.Y soy Asha Giller. También del Instituto de Biociencias Energéticas. Los organismos están rodeados de matrices extracelulares que, dependiendo del organismo, consisten en complejas redes poliméricas.

Una forma rápida y sensible de evaluar la matriz extracelular es un método que denominamos óleum corto de perfil de masa oli, que os mostraremos hoy. Este procedimiento también se puede realizar directamente sobre el tejido vegetal. Así que comencemos.

Comience este procedimiento aislando la matriz extracelular o pared celular de los tejidos vegetales. Coseche cinco plántulas de arabidopsis o la cantidad equivalente de otro material vegetal y transfiéralas a un tubo de reacción de 1,5 mililitros. Asegúrese de que el material esté colocado en el fondo del tubo.

Agregue dos bolas de metal de tres milímetros al tubo de reacción y congele el nitrógeno líquido. A continuación, muele la muestra congelada con un molino de bolas durante 2,5 minutos a 25 hercios. Después de moler el material, agregue un mililitro de etanol acuoso al 70% a la muestra.

Retire bien las bolas de metal con un imán y el vórtice. Este tratamiento solubiliza la mayoría de las proteínas y orgánulos celulares y centrifuga la muestra a 14.000 rpm durante 10 minutos para pellet el residuo insoluble en alcohol. Representando el material de la pared celular, aspire cuidadosamente el sobrenadante, asegurándose de no perturbar la pellet.

Agregue bien un mililitro de solución de metanol de cloroformo al pellet que queda en el vórtice del tubo. Para resuspender el pellet y centrifugar el cloroformo, el metanol extrae compuestos hidrofóbicos como los lípidos. Después de la centrifugación, retire el snat y seque el pellet por completo Con una centrífuga de vacío, esto completa el aislamiento del material de la pared celular, que ahora se puede tratar con ligamentos específicos.

El ejemplo demostrado aquí es la solubilización de Xlo glucano, la principal hemicelulosa presente en las paredes celulares de plantas dicotiledóneas como Arabidopsis El Xlo glucano es un polímero que consiste en una columna vertebral de glucano que se sustituye en gran medida con otros residuos de azúcar para la solubilización de este polímero. Se utiliza un endoglucano fúngico para solubilizar esta hemicelulosa, Resus suspende el pellet de pared celular seco y aislado en 25 microlitros de formiato de amonio de 50 milimolares pH 4,5 y añade 0,2 unidades de endogluconato. Agita la suspensión y haz girar el líquido hacia abajo.

Coloque el tubo en una batidora y deje que las paredes se digieran durante 16 horas a 37 grados centígrados agitando. A 300 RPM. Una vez completada la digestión de la pared celular aislada, se retira el disolvente mediante una centrífuga de vacío y se procede a analizar los oligosacáridos liberados mediante espectrometría de masas, las sales y la enzima se eliminan de la muestra digerida utilizando las perlas de resina de intercambio catiónico de Biox MSD 5 0 1.

Las cuentas se acondicionan primero colocando la cantidad necesaria en una columna vacía y lavando las cuentas con abundante agua. Agregue de cinco a 10 perlas de catión biox acondicionadas a la muestra digerida y seca. Luego agregue 10 microlitros de agua para reducir las cantidades de material.

Se pueden utilizar cinco microlitros de agua. Sumerja las perlas en la solución girando brevemente el tubo, incube durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente mientras el digesto se incuba con las perlas. Localice dos microlitros de matriz DHB en una placa objetivo mal D.

Evapore el solvente de la matriz al vacío, lo que lleva a los cristales químicos de la matriz, ahora detecte dos microlitros de la solución de digestión desalinizada. En la parte superior de los cristales de la matriz en la placa objetivo. El disolvente de la mancha de la matriz de la muestra se evapora de nuevo al vacío.

Es importante mantener un período de tiempo adecuado para la mezcla del líquido de la matriz de la muestra antes de la cristalización, como se describe en detalle en el protocolo escrito adjunto. Una vez que la muestra se haya secado, coloque la placa objetivo en un espectrómetro de maldi a masas. Ponga la máquina en modo positivo con un voltaje de aceleración de 20.000 voltios y un retraso de 350 nanómetros.

El rango de masa seleccionado para estos ligamentos de hemicelulosa es de 500 a 3000 Daltons. El rango de masa debe modificarse de acuerdo con el tamaño de los ligamentos esperados. Comience a disparar el láser y recoja de 100 a 200 espectros por muestra, que se compilan para generar un espectro promedio representativo.

Este es el espectro de la hemiccelulosa oly. El método oly demostrado en este video también se puede usar directamente sobre el tejido de la planta, omitiendo cualquier paso de preparación de la pared. Este procedimiento de análisis in situ se demuestra en plántulas de arabidopsis cultivadas en oscuro.

El espécimen se coloca directamente sobre una placa objetivo y se seca al aire hasta obtener la plántula seca en la placa. Agregue 0,5 microlitros de la mezcla tampón enzimática adecuada en las posiciones deseadas. Asegúrese de que la gota de enzima toque parcialmente el tejido y la placa objetivo.

Coloque la placa objetivo maldi en un recipiente cerrado con humedad saturada para evitar que se sequen las gotas de enzimas. Incubar la placa durante 16 horas a 37 grados centígrados. Al final del período de incubación, seque la mancha enzimática al vacío y agregue 0,5 microlitros de la matriz líquida de DHB encima de cada mancha enzimática seca.

A continuación, seque la placa objetivo MALDI al vacío. Para analizar el NC se tomaron dos muestras. Coloque la placa objetivo, incluidos los puntos de la matriz enzimática de la muestra de tejido, en un espectrómetro múltiple a espectros de masas de registro, utilizando la misma configuración que para la muestra de pared celular aislada.

Comience a disparar el láser sobre la matriz. Muestra de cristales junto al tejido. Asegúrese de no golpear el tejido en sí, ya que en tal caso, el tiempo de vuelo de las moléculas estará apagado.

Recolectar alrededor de 20 a 50 espectros por punto y compilarlos para generar un espectro promedio representativo. Este es un espectro promedio representativo de los oligosacáridos derivados del glucano HemosIL presente en los AOP. Las plántulas, las intensidades de iones o la altura de los iones de todos los iones de interés se suman hasta el 100%, lo que da como resultado la abundancia relativa de los diversos oligosacáridos.

El resultado del método NC dos OMP da resultados similares. Cada gota de digestión enzimática marcada por un círculo de color se puede analizar de forma independiente y se pueden obtener y analizar los espectros de masas correspondientes. Oola también se puede realizar en otros polímeros de la matriz extracelular si se dispone de una enzima hidrolizante adecuada.

A modo de ejemplo, se trata de un espectro oola de la hemocelulosa cilina presente en el cultivo bioenergético. Ms.Canus para obtener los datos presentados mientras el material de una hoja de mecampus era digerido con la xin. Para la asignación de estructuras a los iones, consulte el protocolo adjunto.

Acabamos de mostrarle el procedimiento de perfilado masivo de oligo mar en métricas exo celulares. Polímeros, Al realizar este procedimiento, es importante recordar que los mejores resultados se pueden obtener cuando se obtienen resultados de matriz homogénea para el análisis OV MS. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con los experimentos.