Crioconservazione del cervello murino mediante congelamento rapido: una tecnica per congelare rapidamente un intero campione di cervello di topo per l'analisi istologica

Per crioconservare un campione di cervello murino mediante congelamento rapido, iniziare prendendo un becher riempito con una soluzione di isopentano - un liquido altamente conduttivo - e immergerlo in un barattolo contenente azoto liquido.

Congelare l'isopentano fino a quando la soluzione diventa viscosa.

Nel frattempo, prelevare un campione intero di cervello di topo preceduto da una soluzione di saccarosio. Questo trattamento previene la deformazione del tessuto cerebrale nelle fasi successive.

Rimuovere il campione di cervello dalla soluzione di saccarosio e asciugarlo per rimuovere eventuali tracce di saccarosio.

Quindi, posiziona il cervello nell'orientamento desiderato in un criomold profondo contenente uno strato di terreno di inclusione.

Sovrapponi il cervello nel criopoldo con più mezzi di inclusione per assicurarti che l'intero organo sia coperto.

Quindi, immergere il criomold contenente il cervello incorporato nel bagno di isopentano pre-raffreddato. Il rapido raffreddamento del tessuto cerebrale a una temperatura ultra-bassa garantisce la conservazione dell'architettura cerebrale senza alcuna distorsione.

Ora, lasciare congelare il campione di cervello fino a quando il mezzo di inclusione non si solidifica formando uno strato gelatinoso attorno al cervello, tenendolo in posizione.

Una volta congelato, rimuovere il criomold dal bagno di isopentano e avvolgere il cervello di topo crioconservato in un foglio di alluminio.

Conservare il campione a meno ottanta gradi Celsius per ulteriori analisi istologiche.

Per prepararsi alla crioconservazione, riempire un barattolo con isopentano/2-metilbutano freddo e mettere il barattolo in un contenitore riempito con azoto liquido. Mentre il solvente si sta raffreddando, asciuga il cervello su un pezzo di carta da filtro e posiziona il cervello in un criostampo etichettato.

Aggiungere con cautela circa 5 millilitri di mezzo di taglio a temperatura ottimale al centro del criomold e posizionare il cervello nello stampo con l'orientamento desiderato. Utilizzando una pinza pulita, posizionare rapidamente il criomold nell'isopentano/2-metilbutano raffreddato per 30-40 secondi.

Una volta che il mezzo di taglio si è solidificato, trasferisci il criomold su ghiaccio secco e avvolgi il criomold e il tessuto cerebrale congelato in un foglio di alluminio per una conservazione a meno 80 gradi Celsius.