Induzione del glioblastoma mediante trasposizione mediata da SB: una tecnica per generare un nuovo modello murino utilizzando l'integrazione mediata da trasposoni del plasmide SB nel cervello di topo neonatale

Inizia prendendo una provetta contenente un mix di plasmidi. Il plasmide trasposone della bella addormentata o SB è progettato per trasportare un elemento trasponibile che comprende un oncogene che induce il glioblastoma di derivazione umana inserito tra due sequenze ripetute invertite. Inoltre, questa miscela contiene un plasmide trasposasi SB che ha un elemento che esprime l'enzima trasposasi.

A questo punto, aggiungere un reagente di trasfezione adatto alla provetta. Aspirare la miscela per iniezione in una siringa dotata di microago. Quindi, fissare un cucciolo di topo anestetizzato in posizione prona su un telaio stereotassico. Visualizza la regione della testa del cucciolo per individuare le suture craniche. Posizionare il microago sopra le suture craniche.

Iniettare la miscela nel ventricolo laterale, una cavità all'interno del parenchima cerebrale. Successivamente, la soluzione si disperde nel parenchima cerebrale, dove le molecole reagenti di trasfezione facilitano l'ingresso dei plasmidi all'interno delle cellule. Una volta all'interno della cellula, il plasmide della trasposasi esprime le molecole dell'enzima trasposasi, che riconoscono le sequenze ripetute invertite e asportano l'elemento trasposone.

L'elemento trasponibile DNA si reintegra quindi nella regione di ripetizione TA del DNA genomico del cucciolo. La trasposizione genetica provoca una trasformazione oncogenica delle cellule cerebrali, portando allo sviluppo di glioblastoma nel cervello del topo.

3 o 4 settimane prima dell'esperimento, allestire una gabbia per l'allevamento di topi con un maschio e una femmina. Includi un igloo di plastica colorata per arricchire l'ambiente e aumentare le possibilità di accoppiamento. Rimuovi il maschio una volta che la gravidanza è stata confermata e, 18 giorni dopo il giorno dell'accoppiamento, inizia a monitorare la femmina per il parto. Assicurati che una madre surrogata sia disponibile al momento del parto.

Il primo giorno postnatale, eseguire le iniezioni intraventricolari. Preparare la soluzione iniettabile aliquotando prima 20 microlitri della miscela di DNA contenente i plasmidi del trasposone ad una concentrazione finale di 0,5 microgrammi di DNA per microlitro. Successivamente, aggiungere un'aliquota da 20 microlitri di soluzione di PEI alla soluzione di DNA e lasciarli incubare a temperatura ambiente per 20 minuti o un'ora, dopodiché la miscela deve essere conservata in ghiaccio.

Per l'ago per iniezione, collegare una siringa da 10 microlitri a un ago ipodermico calibro 30 smussato a 12,5 gradi. Quindi, collegare la siringa a una pompa con iniezione automatica. Testare la configurazione con 10 microlitri di acqua e assicurarsi di svuotare la siringa. Ora, rinfresca lo stadio stereotassico neonatale con un impasto di ghiaccio secco e alcol. Quando si è raffreddato tra i 2 e gli 8 gradi Celsius, procedere con le iniezioni.

Anestetizzare un cucciolo mettendolo sul ghiaccio per 2 minuti. Mentre il cucciolo è in ghiaccio, caricare la siringa con la soluzione iniettabile. Una volta anestetizzato, trasferisci il cucciolo sul telaio e immobilizza la testa tra le barre auricolari ricoperte di garza. Verificare che il lato dorsale del cranio sia orizzontale e parallelo alla superficie della montatura. Inoltre, le suture craniche dovrebbero essere chiaramente visibili.

Se la testa del cucciolo non è immobilizzata abbastanza saldamente, si muoverà durante l'iniezione, mentre se viene schiacciata troppo saldamente tra le barre auricolari del telaio, la lambda non sarà visibile e la pressione all'interno della testa costringerà la soluzione iniettata a fuoriuscire.

Con il cucciolo afferrato saldamente dal telaio, pulire la testa con etanolo al 70%. Quindi, abbassare l'ago e regolarne la posizione in modo che tocchi la lambda. Quindi, solleva l'ago e spostalo di 0,8 millimetri lateralmente e 1,5 millimetri rostralmente. Quindi, abbassalo di nuovo fino a quando non increspa leggermente la pelle. Registra le coordinate di questa posizione. Quindi, abbassare l'ago di 1,5 millimetri attraverso la pelle e il cranio e nella corteccia al ventricolo laterale.

Lì, iniettare 0,75 microlitri in 90 secondi e attendere un minuto per far disperdere la soluzione. Durante l'attesa, il prossimo cucciolo da iniettare può essere anestetizzato. Dopo l'attesa, solleva lentamente l'ago. Quindi, trasferisci il cucciolo in un luogo di recupero sotto una lampada riscaldante. Il tempo che intercorre tra l'anestesia e il riscaldamento deve essere inferiore a 10 minuti; Più veloce è, meglio è.

Monitora la sua respirazione e, se necessario, strofina delicatamente gli arti per stimolare la respirazione. Una volta che il cucciolo si è riscaldato, ha un colore rosato e un respiro costante, restituiscilo alla madre.