Qual è l'importanza della scissione delle proteine di punta?

La scissione delle proteine di punta è cruciale per l'ingresso virale nelle cellule ospiti, permettendo al virus di infettare.

Come funzionano i peptidi fluorogenici in questo saggio?

I peptidi fluorogenici contengono un fluoroforo e un quencher; la scissione li separa, permettendo la misurazione della fluorescenza.

Quale ruolo giocano le proteasi ospiti?

Le proteasi ospiti scissiono le proteine di punta, facilitando l'esposizione dei peptidi di fusione necessari per l'ingresso virale.

Qual è stata la principale scoperta riguardo ai peptidi di tipo selvatico e varianti?

I peptidi di tipo selvatico hanno mostrato tassi di scissione più elevati rispetto ai peptidi varianti, indicando un'attività proteolitica alterata.

Quali sono le implicazioni di questo studio?

I risultati possono aiutare a comprendere i meccanismi di ingresso virale e sviluppare strategie antivirali.

Un saggio di scissione del peptide fluorogenico per lo screening dell'attività proteolitica delle proteasi

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

0 views • 2:42 min • July 8th, 2025

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I virus avvolti con proteine spike transmembrana contengono un sito di scissione proteolitico.

Le proteasi legate alla membrana sulle cellule ospiti scindono le proteine spike, esponendo peptidi di fusione che facilitano l'ingresso del virus.

Per iniziare, prendi i peptidi wild-type con il sito di scissione canonico e i peptidi varianti, ciascuno con una mutazione unica nel sito.

I peptidi fluorogenici contengono un fluoroforo e un quencher. A causa della prossimità, il quencher assorbe la fluorescenza del fluoroforo.

Prelevare una piastra a più pozzetti su ghiaccio, contenente tampone di saggio e proteasi dell'ospite.

Aggiungere i peptidi wild-type e varianti in pozzetti separati. Incubare a una temperatura appropriata per un'attività ottimale della proteasi.

La proteasi scinde i peptidi, separando il quencher dal fluoroforo e consentendone l'emissione di fluorescenza.

Misurare la variazione del segnale di fluorescenza per determinare il tasso di scissione proteolitica.

Un tasso più alto per la sequenza wild-type indica una maggiore attività proteolitica, mentre un tasso più basso per le varianti indica un'alterata efficienza di scissione.

Preparare i tamponi di dosaggio appropriati per le proteasi come descritto nel protocollo di testo e raffreddare i tamponi su ghiaccio. Posizionare una piastra a 96 pozzetti in polistirene nero solido non trattato a fondo piatto sul ghiaccio con una sottile piastra metallica sottostante per supportare il raffreddamento e la stabilità.

È essenziale utilizzare una piastra nera come piastra di analisi per evitare perdite fluorescenti dai pozzetti adiacenti.

Per peptide, preparare tre repliche tecniche per saggio in un volume totale di 100 microlitri per campione. Pipettare la quantità appropriata di tampone per il saggio in ciascun pozzetto della piastra del saggio. Aggiungere 0,5 microlitri di proteasi a ciascun pozzetto. A sei pozzetti, aggiungere 0,5 microlitri di tampone invece della rispettiva proteasi. Tre di questi saranno controlli in bianco e gli altri tre saranno controlli peptidici.

Aggiungere 5 microlitri di peptide a una concentrazione finale di 50 micromolari per ciascun pozzetto, ad eccezione dei controlli in bianco. A ciascuno dei tre pozzetti di controllo in bianco, aggiungere 5 microlitri di tampone invece del peptide. Inserire la piastra nel lettore di piastre a fluorescenza e fare clic su Avvia.