Name: Protocol voor Plasmodium falciparum Infecties in Muggen en Infection Fenotype Bepaling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Leer een protocol voor Plasmodium falciparum infecties in muggen en het bepalen van infectie fenotypes in de middendarm. Deze methode helpt onderzoekers malariaparasieten bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

A. Bereiding van gametocyt cultuur: <ol><li> Breng vers menselijk bloed en serum tot 37 o C in een waterbad. </li><li> In een zuurkast, onder steriele omstandigheden, pipet 1 ml warm bloed in een eppendorfbuisje. Spin het bloed in een centrifuge gedurende 5 minuten bij 2200 rpm. Erytrocyten moet worden gepelletiseerd; te verwijderen en gooi de heldere serum. Was erythocytes met een gelijk volume van nieuwe serum drie keer om de volbloed voor de gametocyten te verkrijgen. </li><li> Haal de gametocyt cultuur van de CO 2 incubator of kaars pot. Deze cultuur moet worden gehandhaafd op RPMI media en gevoed aan de muggen op dag 16 van de cultuur. Voor het bepalen van de gametocytemia% (op dag 16 van de cultuur) een dunne uitstrijkje op een glasplaatje met een druppel bloed en het uitvoeren van een Geimsa vlek. Bepaal het aantal van gameten in een veld van de parasiet cultuur. Het is meestal in het bereik van 2 - 4%. Bereken het volume van het bloed dat je nodig hebt om de gewenste uiteindelijke% gametocytemia (0,3 -1%) te bereiken. </li><li> Verwijder het merendeel van de media van uw gametocyt cultuur met behulp van een pipet, en zorg niet te verstoren of tot zuigen de parasieten (parasieten verschijnt als zwart, terwijl de media zullen worden licht roze / rood). Pipetteer de rest van de media en parasieten in een 15 ml falcon buis. Spin in een centrifuge gedurende 5 minuten bij 2200 rpm. Parasieten en erytrocyten zullen pellet, te verwijderen en gooi media supernatans zonder storende parasieten. </li><li> Combineer parasieten met het volume van de bereide volbloed (van stap A2) om u de gewenste uiteindelijke gametocytemia volgens eerdere berekeningen. Pipet om goed te mengen. (~ 1 minuut) </li></ol> Dit is nu de sample die u zal voeden van uw muggen. Bewaren bij 37 ° C in een waterbad. B. Feeding muggen: <ol><li> Zet uw Anopheles muggen (~ 30-50) in de wax-beklede kartonnen bekers bedekt met gaas gaas beveiligd door een rubberen band of kartonnen deksel geleverd met beker. We maken gebruik van een batterij-aangedreven aspirator voor deze stap. </li><li> Bereid de circulatie water-bad door het invoegen van sproeiers aan beide kanten van glas feeders aan rubber slang. Sluit zo veel feeders als je nodig hebt in een serie, een einde van de serie moet worden aangesloten door slang aan op de circulatiepomp van het waterbad (het deel dat water duwt door de feeders), moet het andere uiteinde van de serie bestaat uit rubber slangen ondergedompeld in het bad, zodat het water verspreid om terug leeg in bad. Zet het bad totdat het water is ongeveer 37 o C en het water circuleert door de feeders en weer terug naar het bad. Dit is essentieel om het bloed warm te houden en de parasieten in leven te houden. </li><li> Bereid de membraan (we gebruik van kleine vierkantjes uitgerekt Parafilm) door het uitrekken van rond de glazen membraan feeder, met behulp van druk om goed af, de feeder opening. Dit membraan wordt de huid na te bootsen. </li><li> Plaats een feeder membraan naar beneden op elk mug cup en veilig feeders met behulp van klemmen of tape. Het membraan moet spoelen zitten met het net, zodat muggen kunnen er toegang vanuit de beker. </li><li> Zorgvuldig pipet parasiet-bloed maaltijd (van stap A5) in de hals van de feeder, zorg ervoor dat het bloed gaat helemaal door de nek in het reservoir, contact opnemen met de membraan, zodat de muggen kunnen het bloed te openen. We maken gebruik van ongeveer 200 ul bloed per feeder, maar dit kan variëren. </li><li> Laat muggen te voeden. We kunnen ze voer voor ≈ 30 minuten (variabel, afhankelijk van de theexperiment, voor de meeste experimenten, zo nu en dan controleren hoe velen hebben al een maaltijd innemen door te kijken naar het bloed-gehalte in de buik.) </li><li> Na het voeden, verwijder feeders uit de mug bekers. Zet het waterbad en koppel feeders van de slang. </li><li> Verwijder het membraan en genieten feeders in 10% bleekwater te ontsmetten en spoelen met water. Plaats verontreinigd materiaal (membranen, papieren handdoeken, handschoenen, etc) in een kleine biohazard tas en deponeren in een grote biohazard opvangbak. </li><li> Verdoven muggen door het plaatsen van cups in koelkast of koude kamer. Zodra muggen zijn volledig verdoofd, breng ze op een petrischaaltje ingebed in een ijsemmer. Soort muggen, zorgvuldig te kijken naar de buik op tekenen van een bloedmaaltijd, en gooi die dat niet deden feed. Sommige muggen wordt volledig gezwollen terwijl anderen zullen een smalle band van ingeslikt bloed te zien, alle aanvaardbaar zijn als &quot;gevoed&quot;. Leg de gevoed muggen in de kartonnen bekers. </li><li> Zorg voor een suiker eten (een stuk katoen gedrenkt in 10% sucrose) aan muggen en incubeer onder normale omstandigheden insectary gedurende 7 dagen. Elke dag moet de muggen gecontroleerd worden op het sterftecijfer. Ook moet de katoen nat worden gemaakt met de sucrose, zodat ze niet verstoken zijn van voedsel. Het is beter, maar toch, op een papieren handdoek gedrenkt in gedestilleerd water toe te voegen, houden de muggen vochtig. Deze muggen zijn P. falcipraum besmet, dus alle zorg moet worden genomen zodat er geen muggen kunnen ESCAPe uit de beker. Het beste is om de cups in een kleine cagefor dubbele bescherming. </li></ol> C. ontleden mug midguts en het inschatten van oocysten belastingen: <ol style="margin-top: 0in"><li style="tab-stops: list .5in"> Aspireren muggen (van stap B) van karton cups met behulp van een batterij-aangedreven aspirator. Verdoven muggen, die zich binnen de verwijderbare aspirator reservoir, door te verhuizen naar een koude kamer of het begraven van de reservoir in ijs gedurende minstens 5 minuten of tot muggen stoppen met bewegen. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Overdracht onder narcose muggen uit het reservoir naar een glazen petrischaal ingebed in ijs. Spreid de muggen op een enkele laag en dek af met een plastic petrischaal deksel. Muggen die niet kan worden ondergebracht op de schotel te blijven in het reservoir, die wordt teruggegeven aan koude kamer of ijs. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Met behulp van fijne punt pincet, de overdracht van een enkele mug van de schotel naar 100 ul PBS die op een glasplaatje gemonteerd onder een dissectie microscoop. Laat de anderen behandeld in de gekoelde petrischaal. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Met behulp van fijne punt tang, houdt muggen op de thorax en de achterste buik. Uit elkaar te trekken van het lichaam tot de middendarm is blootgesteld. Gebruik een tang om overtollig weefsel te verwijderen uit gut.The darm ziet eruit als een witte, zak-achtig lichaam. Verwijder overtollig weefsel uit de gut.Mount de darm in een well van een 12-wells glasplaatje en dompel 5-10 ul van 0,2% Mercurochroom. Squash het karkas en gooi op vochtig papier towel.Continue voor andere muggen totdat de 12-well slide is vol. Bedek de gemonteerde lef met een glazen dekglaasje aan. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Onderzoek lef onder een lichtmicroscoop, op zoek naar ronde oöcysten die fel roze vlek tegen de duidelijke / lichtrose darmweefsel. Graaf oöcysten, opnemen en verder met de volgende monster. Blijven voor alle muggen van alle experimentele behandelingen. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Wanneer u klaar bent, veegt glijbaan schoon met een papieren handdoek. Plaats het papier handdoek met lef, en papier handdoek met karkassen, in kleine Biohazard tas en gooi in de prullenbak. Handschoenen worden gedragen gedurende de procedure. Er wordt op gelet dat er geen geïnfecteerde muggen te laten ontsnappen. </li></ol>

<ol><li>Avila, S. L., Ferreira, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+diagnosis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Malaria diagnosis: a review.</a> Braz J Med Biol Res. 29 (4), 431-443 (1996).</li>
<li>Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+assay+for+quantifying+Plasmodium+falciparum+infections+in+the+mosquito+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector.</a> Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).</li>
<li>Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Plasmodium+malariae+infection+in+mosquito+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Trop+Med+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors.</a> Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).</li>
<li>Czeher, C., Labbo, R., Djibrilla, A., Here, L., Arzika, I., Duchemin, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+study+of+oocyst-sporozoite+transition+in+malaria+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">ELISA study of oocyst-sporozoite transition in malaria vectors.</a> Parasite. 13 (3), 257-261 (2006).</li>
<li>Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+results+of+light+microscopy+with+the+results+of+PCR+method+in+the+diagnosis+of+Plasmodium+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vector+Borne+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax.</a> J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).</li>
<li>Patsoula, E., Spanakos, G., Sofianatou, D., Parara, M., Vakalis, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-step%2C+PCR-based+method+for+the+detection+and+differentiation+of+Plasmodium+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Trop+Med+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A single-step, PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax.</a> Ann Trop Med Parasitol. 97 (1), 15-21 (2003).</li>
<li>Osta, M. A., Christophides, G. K., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mosquito+genes+on+Plasmodium+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Effects of mosquito genes on Plasmodium development.</a> Science. 303 (5666), 2030-2032 (2004).</li>
<li>Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Plasmodium+and+Anopheles+transcriptomes+during+oocyst+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation.</a> J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).</li>
</ol>

Kunnen er een aantal variaties in de Plasmodium infectie en besmetting fenotype vastberadenheid en verschillende labo&#39;s kunnen volgen verschillende technieken.

protocol voor plasmodium falciparum infecties in muggen en infection fenotype bepaling

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Zodra een gen is geïdentificeerd als potentieel vuurvaste voor malaria, dient te worden geëvalueerd voor zijn rol in het voorkomen van Plasmodium besmettingen binnen de mug. Dit protocol illustreert hoe de mate van plasmodium infecties van muggen kunnen worden getest. De technieken voor de voorbereiding van de gametocyt cultuur, membraan voeden muggen menselijk bloed, en het testen van virale titers in de mug middendarm worden gedemonstreerd.

Protocol voor Plasmodium falciparum Infecties in Muggen en Infection Fenotype Bepaling

Zodra een gen is geïdentificeerd als potentieel refractair voor malaria, moet de rol ervan bij het voorkomen van Plasmodium-infecties binnen de ... worden geëvalueerd.

Ik ben George Dimopoulos van het Malaria Research Institute aan de Johns Hopkins School of Public Health, en we gaan u nu een procedure laten zien over hoe u Anopheles gambiae-muggen infecteert met Plasmodium falciparum-parasieten, en hoe u het infectiefenotype in de middendarm van de mug bepaalt. Voor deze procedure is de volgende basisapparatuur nodig: we hebben een CO2-incubator nodig voor de parasietcultuur. Als alternatief, indien u geen CO2-incubator heeft, kunt u een kaarsglas gebruiken.We hebben natuurlijk ook een insectarium nodig, साथ alsovoren standaardapparatuur voor moleculaire biologie en celbiologie, zoals dissectiescopen en lichtmicroscopen. We hebben waterbaden nodig. We hebben een membraanvoersysteem voor muggen en centrifuges nodig.Hoi, mijn naam is ISH en ik werk in het laboratorium van Dr. George Depos. Ik ben een postdoc. Mijn naam is Lindsay Garver en ik ben een PhD-student.De eerste stap bij de infectie van het plasma is het gereedmaken van de plasmacultuur. Als u geen kooldioxide-incubator heeft, kunt u een glazen pot met een kaars gebruiken waarin u de six-wellplaat met de gatocultuur plaatst; steek vervolgens de kaars aan en sluit de pot af. De volgende stap is het klaarleggen van vers menselijk bloed en serum, die eerst in een waterbad op 37 °C worden geplaatst om ontdooiing te bewerkstelligen en om ze op te warmen, aangezien er echt warm bloed en warm serum nodig is.Om het bloed voor te bereiden, moet u een aliquot van vers menselijk bloed in een centrifugebuis overbrengen. Het verse bloed moet vervolgens gedraaid worden op 2000 RPM gedurende vijf minuten om de erytrocyten te sedimenteren. Na afloop van het centrifugeren moet het heldere supernatant worden weggegooid en de rode pellets, de RBC's, drie keer gewassen worden in menselijk serum.We voegen een gelijk volume menselijk serum toe aan het pellet, mengen deze en centrifugeren opnieuw bij 2000 RPM gedurende vijf minuten. Deze stap wordt drie keer herhaald. Ten slotte zijn de rode bloedcelpellets klaar om aan de ganote-cultuur te worden toegevoegd.De Plasmodium-cultuur, die zich in de CO2-incubator bevindt, moet 16 dagen lang in RPMA-medium worden onderhouden; op dag 16 zijn ze klaar voor de infectie. Aangezien we met de Plasmodium-cultuur werken, moet er bij elke stap voorzichtig worden te werkgegaan. De eerste stap is dat de parasieten in een BSL-2 laboratorium moeten worden gekweekt en dat dit in een zuinigkast moet gebeuren.Alle pipetpunten en alle Eppendorf-buisjes moeten worden weggegooid in een biohazard-container en eventuele andere oplossingen, zoals onze pipetinhoud, moeten worden behandeld. Deze moeten worden gewassen in 10% bleekmiddel en u dient handschoenen te dragen. Voor de kweek van dag 16 dient men een kleine bloeddruppel op een glasplaatje aan te brengen, een uitstrijkje te maken en een Giemsa-kleuring uit te voeren, gevolgd door observatie onder de lichtmicroscoop.We kunnen het GAMMAT-percentage bepalen uit de 16 dagen oude gametocytenkweek. Verwijder het grootste deel van het medium en zorg ervoor dat u de parasieten niet verstoort of opzuigt, aangezien deze zich gemakkelijk op de bodem bevinden; pipetteer de rest van het medium en de parasieten over. Meng de parasieten in de rode bloedcellen en centrifugeer de parasieten vervolgens bij 2000 RPM gedurende vijf minuten.Na het centrifugeren zullen de parasieten samen met de rode bloedcellen bezinken. De supernatant bestaat uit het RPMI-medium en onderin bevindt zich de pellet met de parasieten. Verwijder de supernatant, het RPMI, terwijl de rode bloedcellen behouden blijven.Er moet zorgvuldig met het medium worden omgegaan om te voorkomen dat de parasiet en de rode bloedcellen worden verstoord. Het GATOT-percentage, dat wordt bepaald door de GIMs 10, ligt gewoonlijk in de range van 2 tot 4%. Wanneer de rode bloedcellen en de parasieten na het centrifugeren klaar zijn, worden ze samen gemengd en wordt het volume bloed dat moet worden toegevoegd bepaald op basis van het uiteindelijke GATOT-percentage. Dit moet accuraat zijn en ligt gewoonlijk in de range van 0,3 tot 1%; dit is wat zal worden gebruikt voor de voeding van de phys-muggen.Voor de Presidium S-infectie gebruiken we dit glazen voerapparaat voor de membraanvoeding van de muggen. We brengen het bloed binnen via het kleine gaatje dat u ziet, waarna het daarin wordt opgevangen. Aan de onderzijde bevinden zich twee nozzles die zijn verbonden met ons waterbad, dat is ingesteld op 37 °C.Om de voeder voor de voeding voor te bereiden, nemen we een klein stukje affil. We rekken dit vanuit de twee uiteinden en vanaf alle vier de zijden uit, en plaatsen het vervolgens op de open zijde van de glazen voeder om een dun membraanlaagje te vormen dat de huid nabootst. Dit wordt membraanvoeding genoemd.Dit is een circulerend waterbad, dat het water op 37 °C houdt en het water tevens door de glazen toevoer laat circuleren, zodat het bloed warm wordt gehouden op 37 °C. We verbinden de glazen toevoer via de kleine capillairen met het circulerende waterbad en schakelen het waterbad in, zodat het water circuleert; het water en het bloed mengen nooit omdat ze zich in twee gescheiden kamers bevinden. Dit is een klein bekertje met daarin *Anopheles gambiae*-muggen.Om te beginnen wordt de glazen voeder bak op de kooi geplaatst en wordt er een gewicht op de glazen voeder bak gelegd, zodat het membraan, het phim, vlak ligt tegen het gaasnet. Ongeveer 200 µL van het bloed, dat de parasieten bevat met het vereiste gambotto-percentage, wordt aan de voeder bak toegevoegd. Er dient hierbij op gelet te worden dat het bloed volledig naar beneden vloeit, zodat de muggen toegang hebben tot het bloed.Het voeren wordt ongeveer 30 minuten voortgezet. Zodra het voeren is voltooid, wordt de glazen voederbak grondig gewassen in 10% bleekmiddel, en worden de overige membranen en tape verwijderd en weggegooid in een biohazard-container. Na het bloedvoeren moeten de niet-gevoede muggen worden gescheiden van de gevoede exemplaren.Om dit te doen, hebben we de muggen verdoofd door de kleine bekertjes met de bloedgevoede muggen gedurende vijf tot 10 minuten in een koelkamer te plaatsen. Zoals we kunnen zien, zijn de muggen door de kou al knock-out. We openen het deksel en brengen de muggen over naar een kleine petrischaal, die op een ijsemmer is geplaatst zodat de muggen gedurende het hele proces koud blijven en niet kunnen ontsnappen.Onthoud dat dit met plasmodium geïnfecteerde muggen gaat, dus er moet uiterste zorg worden betracht om te voorkomen dat ze ontsnappen. Zodra de muggen in de koelruimte zijn, brengen we ze over naar het normale insectarium, dat op kamertemperatuur wordt gehouden, maar we plaatsen de muggen altijd in een petrischaal die in een ijsemmer wordt bewaard, zodat ze constant verdoofd blijven. U kunt zien hoe de gevoede muggen van de ongevöede muggen kunnen worden gescheiden.De gevoede exemplaren bevatten bloed. Zij zijn volledig verzadigd. Sommigen hebben gedeeltelijk bloed geconsumeerd en zijn daarom niet volledig verzadigd.Sommige hebben een kleine hoeveelheid bloed in hun abdomen, terwijl anderen veel bloed in hun abdomen hebben. De niet-gevoede exemplaren hebben helemaal geen bloed in hun abdomen, waardoor u heel gemakkelijk het onderscheid kunt maken tussen de gevoede en de niet-gevoede exemplaren. Hier zijn de volwassen vrouwelijke muggen die gevoed zijn met bloed; we zullen deze muggen nu van de petrischaal overbrengen naar de wax-gecoate kartonnen bekertjes.Nadat de met bloed gevoede muggen in de bekers zijn geplaatst, voegen we een klein stukje watten toe dat is gedrenkt in 10% sucrose, zodat ze de komende zeven dagen van deze 10% sucrose kunnen voeden tijdens de incubatie. Daarnaast voegen we een klein gevouwen stukje keukenpapier toe om het vocht in de beker te behouden en dekken we dit af met een petrischaal. De met plasmodium geïnfecteerde muggen worden in een andere kleine kooi geplaatst, zodat ze een dubbele bescherming hebben, en we plaatsen de kooi in een BSL-3 laboratorium dat op 27 °C en 80% luchtvochtigheid wordt gehouden. Zeven dagen na de bloedmaaltijd worden de muggen die in het insectarium in de dubbele kooi werden gehouden, uit het insectarium gehaald en naar de koelruimte gebracht om ze te verdoven.Nadat de muggen zijn uitgeschakeld, worden ze overgebracht naar een petrischaal die in een ijsemmer wordt bewaard. Nu maken we ons klaar om de muggen te dissekeren. We zullen de middendarm dissekeren en zoeken naar de cyste.De eerste stap is het toevoegen van 100 µL PBS op een glasplaatje dat is geplaatst onder een dissectiemicroscoop. De volgende stap is het gebruik van een pincet. We dragen een enkele mug over van de petrischaal naar de PBS op het glasplaatje onder de dissectiemicroscoop.De overige muggen blijven op de gekoelde petrischaal liggen. Om de muggen te dissekeren, houdt u de muggen bij het borststuk vast met een van de fps en het achterste deel van het abdomen met een andere fp. Trek vervolgens het lichaamsdeel langzaam uit elkaar totdat de middendarm zichtbaar is.Het ziet eruit als een wit zakvormig lichaam; gebruik een pincet om het overtollige weefsel en de andere lichaamsdelen te verwijderen. Ja, dit is de middendarm, die eruitziet als een wit zakvormig lichaam en de eieren bevat. We zullen deze middendarm nu overbrengen naar een 12-well glazen plaat en onderdompelen in 5 tot 10 µL 0,2% micro pro, waardoor de middendarm op de slide gefixeerd wordt.Met het dekglas voeren we deze stap uit voor alle geïnfecteerde muggen. De darm ziet er helderroze uit, en we zullen dezepreparaat naar een lichtmicroscoop overbrengen om de OS-last te tellen. We bekijken nu de middendarm die uit de geïnfecteerde muggen is geprepareerd.De middendarm ziet eruit als een glad lichaam en met de rom-kleuring hebben ze een zeer lichte roze kleur; de O SST zou helder roze moeten zijn tegen het zwak roze darmweefsel. Deze middendarmen zijn echter afkomstig van de geïnfecteerde muggen, maar ze vertonen geen sst, dus ze zijn mogelijk niet geïnfecteerd. Maar als een middendarm geïnfecteerd zou zijn, zou de S zichtbaar zijn als een kleine, helderroze cirkel, en er kunnen soms talloze lag tussen 22 500 zijn binnen één enkele middendarm.Bij deze procedure werd menselijk bloed geïnfecteerd met Plasmodium falciparum-parasieten, waarna deze geïnfecteerde bloed werd gevoerd aan Gambische muggen, de middendarm uit deze muggen werd gedisseceerd en de oöcystenaantallen in die geïnfecteerde middendarmen werden bepaald. Deze techniek is belangrijk omdat het de nauwkeurigste benadering is van de menselijke malari transmissie die we in het laboratorium kunnen repliceren.

protocol-for-plasmodium-falciparum-infections-mosquitoes-infection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zodra een gen is geïdentificeerd als potentieel refractaire voor het dengue virus moet worden geëvalueerd voor zijn rol in het voorkomen van virale infecties in de mug. Dit protocol illustreert hoe de mate van dengue infecties van muggen kunnen worden getest. De technieken voor het groeien van het virus in de cultuur, membraan voeden muggen menselijk bloed, en het testen van virale titers in de mug middendarm worden gedemonstreerd.

Protocol voor Dengue Infecties in Muggen (A. aegypti) en Infectie Fenotype Bepaling

Genetische kruisen van knaagdieren malariaparasieten worden uitgevoerd door het voeren van twee genetisch verschillende parasieten aan muggen. Recombinant nakomelingen zijn gekloond van muizen bloed na waardoor muggen om geïnfecteerde muizen bijten. Deze video laat zien hoe de productie van genetisch kruisen...

Protocol voor de productie van een genetische Kruis van het knaagdieren malariaparasieten

Muggen die malaria overdragen, hebben een aantal epidemiologisch belangrijke kenmerken die alleen kunnen worden gedetecteerd met behulp van moleculaire technieken. Door gebruik te maken van een MALDI-TOF-gebaseerde SNP-genotyperingsplatform, hebben we een test ontwikkeld voor het gelijktijdig detecteren van meerdere belangrijke eigenschappen (soorten, insecticideresistentie, parasietinfectie en gastheukeuze) van malariavectoren.

Een Multi-detectie test voor Malaria Zenden Muggen

Menselijk microRNA transloceert van gastheer erytrocyten naar Plasmodium falciparum parasieten. Hier worden de technieken beschreven die worden gebruikt om synthetische microRNA's in gastheer erytrocyten te transfecteren en alle RNA's uit P. falciparum te isoleren. Daarnaast zal dit artikel een methode voor polysoomisolatie in P. falciparum beschrijven om de ribosomale bezetting en translationele potentieel van parasiet transcripten te bepalen.

Methoden om de regulerende rol van kleine RNA&#39;s en Ribosomaal bezetting van Onderzoek<em&gt; Plasmodium falciparum</em

Als gevolg van de opvallende gelijkenissen van de levenscyclus en de biologie van knaagdieren malariaparasieten voor menselijke malariaparasieten, knaagdieren malaria modellen zijn onmisbaar geworden voor malaria onderzoek. Hierin hebben we enkele van de belangrijkste technieken gestandaardiseerd die worden gebruikt in de fenotypische analyse van wild-type en transgene knaagdier malaria soorten.

Fenotypische analyse van knaagdieren malaria parasiet asexual en seksuele bloed stadia en muggen stadia

Gedetailleerd onderzoek naar muggenstadia van malariaparasieten is van cruciaal belang voor het ontwerpen van effectieve transmissieblokkeringsstrategieën. Dit protocol laat zien hoe infectieuze gametocyten effectief kunnen worden gekweekt en deze gametocyten vervolgens aan muggen kunnen worden gevoerd om muggenstadia van P. falciparumte genereren .

Plasmodium falciparum Gametocytencultuur en muggeninfectie door kunstmatige membraanvoeding

Dit protocol beschrijft een sandwich-enzymgekoppelde immunosorbenttest om speekselkliersporozoïeten bij muggen te detecteren. Met behulp van gemakkelijk verkrijgbare monoklonale antilichamen maakt de methode kosteneffectieve detectie met hoge doorvoer mogelijk van muggen die Plasmodium falciparum of Plasmodium vivax dragen. De methode is geschikt voor onderzoek naar de overdracht van malaria, inclusief vectoronderzoeken.

Detectie van Plasmodium Sporozoïeten bij Anopheles-muggen met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbenttest

De standaard membraanvoedingstest (SMFA) wordt beschouwd als de gouden standaard voor de beoordeling en identificatie van potentiële antimalariaverbindingen. Dit kunstmatige voedingssysteem wordt gebruikt om muggen te infecteren om de effecten van dergelijke verbindingen op de intensiteit en prevalentie van de Plasmodium falciparum-parasiet verder te evalueren.

Standaard membraanvoedingstest voor de detectie van Plasmodium falciparum-infectie in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria wordt overgedragen door inoculatie van het sporozoietstadium van Plasmodium door geïnfecteerde muggen. Transgeen Plasmodium heeft ons in staat gesteld de biologie van malaria beter te begrijpen en heeft rechtstreeks bijgedragen aan de ontwikkeling van malariavaccins. Hier beschrijven we een gestroomlijnde methodologie om transgene Plasmodium berghei sporozoïeten te genereren.

Genereren van genetisch gemodificeerde Plasmodium berghei Sporozoïeten

Chemische genetica omvat de vervanging van een poortwachterresidu door een aminozuur dat een andere zijketen bevat op de doellocus. Hier hebben we een mutante parasiet gegenereerd die een hypomorf allel van cdpk1 bevat en compenserende routes geïdentificeerd die door de parasiet in de mutante achtergrond zijn aangenomen.

Inzicht in de ontwikkeling van compenserende routes in een mutante malariaparasiet die een hypomorf allel van plantachtige kinasen herbergt

De seksuele ontwikkeling van Plasmodium vindt plaats in de middendarm van de mug. Het richten op de seksuele stadia van de parasiet is een veelbelovende strategie om de overdracht te blokkeren. We ontwikkelden Ookluc, een transgene P. berghei die nanoluciferase tot expressie brengt na de vorming van zygoten, waardoor high-throughput screening van transmissieblokkerende verbindingen mogelijk is. In dit artikel worden de methoden voor screening met Ookluc beschreven.

Ookluc: een Plasmodium berghei-lijn voor het identificeren van transmissieblokkerende verbindingen

Leer een protocol voor Plasmodium falciparum infecties in muggen en het bepalen van infectie fenotypes in de middendarm. Deze methode helpt onderzoekers malariaparasieten bestuderen.

Protocol voor Plasmodium falciparum Infecties in Muggen en Infection Fenotype Bepaling

Meer video's verkennen