Name: 覚醒ラットにおける高インスリン血症、正常血糖クランプ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 学ぶ高インスリン血症・正常血糖クランプ法を用いた覚醒ラットのインスリン感受性評価法。カテーテル留置と術後管理により、生理的インスリン濃度下での全身グルコース消失率を直接測定し、代謝疾患研究に有用です。

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この研究は、ヘルスリサーチおよびゲノムCanada.JSのカナダの協会によってサポートされていたがアルバータ遺産Foundationfor医学研究、心臓とCanadaandの脳卒中財団カナダ糖尿病協会から給与を支援賞を保持しています。シアラーの実験室には、この手順を教えるデビッドワッサーマンと氷楽Bracyに感謝。

<ol><li>Halseth, A. E., Bracy, D. P., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+to+basal+and+insulin-stimulated+skeletal+muscle+glucose+uptake+in+the+high-fat-fed+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Limitations to basal and insulin-stimulated skeletal muscle glucose uptake in the high-fat-fed rat.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 279, E1064-E1071 (2000).</li>
<li>Halseth, A. E., Bracy, D. P., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+to+muscle+glucose+uptake+due+to+high+fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Limitations to muscle glucose uptake due to high fat feeding.</a> Am. J. Physiol. 279, E1064-E1071 (2000).</li>
<li>Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+for+assessing+insulin+sensitivity+and+resistance+in+vivo%3A+advantages%2C+limitations%2C+and+appropriate+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, 15-26 (2008).</li>
<li>Cho, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+and+a+diabetes+mellitus-like+syndrome+in+mice+lacking+the+protein+kinase+Akt2+%28PKB+beta%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance and a diabetes mellitus-like syndrome in mice lacking the protein kinase Akt2 (PKB beta).</a> Science. 292, 1728-1731 (2001).</li>
<li>Dubois, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SHP-1+protein+tyrosine+phosphatase+negatively+modulates+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The SHP-1 protein tyrosine phosphatase negatively modulates glucose homeostasis.</a> Nat Med. 12, 549-556 (2006).</li>
<li>Pacini, G., Thomaseth, K., Ahren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+to+glucose+tolerance+of+insulin-independent+vs.+insulin-dependent+mechanisms+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Contribution to glucose tolerance of insulin-independent vs. insulin-dependent mechanisms in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 281, 693-703 (2001).</li>
<li>Herbach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant-negative+effects+of+a+novel+mutated+Ins2+allele+causes+early-onset+diabetes+and+severe+beta-cell+loss+in+Munich+Ins2C95S+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Dominant-negative effects of a novel mutated Ins2 allele causes early-onset diabetes and severe beta-cell loss in Munich Ins2C95S mutant mice.</a> Diabetes. 56, 1268-1276 (2007).</li>
<li>Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+insulin+resistance+in+mice+lacking+adiponectin%2FACRP30%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Diet-induced insulin resistance in mice lacking adiponectin/ACRP30.</a> Nat Med. 8, 731-737 (2002).</li>
<li>Potenza, M. A., Marasciulo, F. L., Tarquinio, M., Quon, M. J., Montagnani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+spontaneously+hypertensive+rats+with+rosiglitazone+and%2For+enalapril+restores+balance+between+vasodilator+and+vasoconstrictor+actions+of+insulin+with+simultaneous+improvement+in+hypertension+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Treatment of spontaneously hypertensive rats with rosiglitazone and/or enalapril restores balance between vasodilator and vasoconstrictor actions of insulin with simultaneous improvement in hypertension and insulin resistance.</a> Diabetes. 55, 3594-3603 (2006).</li>
<li>Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+in+the+design+of+hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+the+conscious+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse.</a> Diabetes. 55, 390-397 (2006).</li>
<li>Wasserman, D. H., Ayala, J. E., McGuinness, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Lost in translation.</a> Diabetes. 58, 1947-1950 (2009).</li>
</ol>

手順は、カルガリー動物ケアの大学および使用委員会によって承認され、実験用の実験動物科学のガイドラインについては、カナダの協会を遵守した。著者らは利害の対立または開示はありません。

最初にヒトのインスリン感受性の調査のために開発、クランプの手順は、現在、実験用ラットやマウスなど他の種に適応されています。インスリン抵抗性の調査を動物モデルでは、インスリン感受性と関連する病理の病態生理を理解するだけでなく、臨床的価値の1,2を持っている治 ​​療的介入を特定するのに重要な援助を提供します。動物のインスリン感受性を評価するいくつかのメソッドは、3を採用されている。このような技術は、ブドウ糖負荷試験のバリエーション（GTTs）およびインスリン負荷試験（ITTS）4-6と同様に空腹時の定常状態7-9由来のインスリン感受性/抵抗のインデックスが含まれています。しかし、インスリン感受性がプライマリ実験目標と技術的実現可能性のときにインスリンクランプを制限していないのは、標準のまま。ここでは、意識、無拘束のラットにおける最も基本的なクランプの手順を示します。変数外因性グルコースが血糖を維持するために注入されながら、インスリンが一定の速度で投与される。動物の循環へのアクセスは、動脈と頚静脈カテーテルの注入によって得られる。動物のストレス（ハンドリ...

<table border="1"><tbody><tr valign="top"><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr valign="top"><td> Intramedicポリエチレンチューブ（PE - 50） </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 14から170 - 12B </td><td> 0.58ミリメートル（0.023&quot;）0.965ミリメートルのX外径（0.038&quot;）の内径</td></tr><tr valign="top"><td>ダウコーニングシラスティックラボチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 11から189 - 15C </td><td> 0.76ミリメートル（0.030&quot;）の内部直径1.65ミリメートルのX外径（0.065&quot;） </td></tr><tr valign="top"><td>タイゴンS - 50 - HLメディカルチューブ</td><td>ハーバード装置</td><td> PY2 72から1251 </td><td> 3.2ミリメートルの内径（0.125&quot;）4.7ミリメートルのX外径（0.1875&quot;） </td></tr><tr valign="top"><td>ロックタイトスーパー接着剤</td><td>グランド＆玩具</td><td> 32237 </td><td>ゲルコントロール</td></tr><tr valign="top"><td>無菌手術ブレード</td><td> VWR </td><td> BD371610 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td>湾曲したマイクロ解剖鉗子</td><td>ジョージティーマンアンドカンパニー</td><td> 160から20 </td><td> × 2 </td></tr><tr valign="top"><td>ストレートマイクロ解剖鉗子</td><td>ジョージティーマンアンドカンパニー</td><td> 160から15 </td><td> × 2 </td></tr><tr valign="top"><td>湾曲した止血剤</td><td>ジョージティーマンアンドカンパニー</td><td> 105-1135 </td><td> × 2 </td></tr><tr valign="top"><td>ストレート止血剤</td><td>ジョージティーマンアンドカンパニー</td><td> 105-1130 </td><td> × 2 </td></tr><tr valign="top"><td>止血鉗子の先端ガード</td><td>ロビンスインスツルメンツ株式会社</td><td> 15.09-2-004 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td>ストレート外科用はさみ</td><td>ジョージティーマンアンドカンパニー</td><td> 105から402 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> VENOJECTマルチサンプルルアーアダプター</td><td>テルモメディカルプロダクツ</td><td> 810127A </td><td> 21ゲージ、1インチ</td></tr><tr valign="top"><td>滅菌カテーテルイントロデューサー</td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 406999 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> 14ゲージのブラントニードル</td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 511310 </td><td> 14ゲージ、2インチ</td></tr><tr valign="top"><td>滅菌縫合糸</td><td>ジョンソン＆ジョンソンメディカルプロダクツ</td><td> 1679H </td><td>シルク、サイズ3〜0 </td></tr><tr valign="top"><td>非滅菌外科用縫合糸</td><td>アンジオテックファーマシューティカルズ</td><td> SP116 </td><td>シルク、サイズ4から0 </td></tr><tr valign="top"><td>綿棒</td><td> VWR </td><td> 10806-005 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> 4plyガーゼパッド</td><td> VWR </td><td> CA43845 - 062 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td>小動物コードレスクリッパーズ</td><td>ハーバード装置</td><td> 729063 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td>イソフルレン</td><td>ハロカーボン製品株式会社</td><td> IPN - 45 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td>麻酔カート</td><td>ベンソン医療産業、（株） </td><td></td><td></td></tr><tr valign="top"><td> 70％エタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> HC - 1000 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Betadineの消毒液</td><td>西洋医薬品流通センター株式会社</td><td> 105267 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td>モデル11 Plusのシリンジポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td> 702208 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td>ステンレス鋼チューブカプラ</td><td>ハーバード装置</td><td> 72から4434 </td><td> 23ゲージ、インチ0.3 </td></tr><tr valign="top"><td>ステンレス鋼チューブのプラグ</td><td>ハーバード装置</td><td> 72から4436 </td><td> 23ゲージ、0.5インチ</td></tr><tr valign="top"><td>ステンレス鋼ブラント針</td><td>インステックラボラトリーズ、（株） </td><td> LS22 </td><td> 22ゲージ</td></tr><tr valign="top"><td> 60 ° Y -コネクタ</td><td>スモールパーツ</td><td> STCY - 22から05 </td><td> 22ゲージ</td></tr><tr valign="top"><td> CritSpinマイクロヘマトクリット遠心機</td><td>アイリスのサンプル処理</td><td> CS12 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td>ミニ遠心機</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 05-090-100 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td>マイクロ遠心チューブ</td><td> VWR </td><td> 53550-778 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> 50ミリリットルポリプロピレン遠心チューブ</td><td> VWR</td><td> 89004-364 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> 1ミリリットルプラスチックスリップのヒントシリンジ</td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> 3ミリリットルプラスチックLuerlokヒントシリンジ</td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td>ヘパリン抗凝固剤の注入</td><td>西洋医薬品流通センター株式会社</td><td> 102824 </td><td>メーカー：LEO製薬株式会社コンク。 1000 IU </td></tr><tr valign="top"><td> EDTA溶液</td><td>プロメガ株式会社</td><td> V4231 </td><td> 0.5 M、pH8.0の</td></tr><tr valign="top"><td>生理食塩水</td><td>西洋医薬品流通センター株式会社</td><td> ABB7983154 </td><td>メーカー：ホスピーラ0.9％塩化ナトリウム</td></tr><tr valign="top"><td> 50％のブドウ糖</td><td> Vetoquinol </td><td> 8DEX012D </td><td></td></tr><tr valign="top"><td>ヒューマリン- R </td><td>イーライリリー</td><td> HI - 210 </td><td> 100U/ml </td></tr><tr valign="top"><td> 1ミリリットルインスリン用注射筒</td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 309311 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Fisherbrand * Hematoシールシーラント</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 02から678 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Fisherbrand * Microhematocritキャピラリーチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 22-362-574 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td>ワンタッチウルトラテストストリップ</td><td> LifeScan、（株） </td><td> AW 085 - 314H </td><td></td></tr><tr valign="top"><td>ワンタッチウルトラ血糖測定器</td><td> LifeScan、（株） </td><td> AW 085 - 314B </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Pentobarbitolナトリウム</td><td>チェバサンテAnimale </td><td> 1715 138 </td><td>コンク。 54.7mg/ml </td></tr><tr valign="top"><td>レッド研究所ラベリングテープ</td><td> VWR </td><td> 89097-932 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td>青い研究所ラベリングテープ</td><td> VWR </td><td> 89097-936 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td>計量器</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 01-913-88 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td>渦</td><td> VWR </td><td> 58815-234 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td>タイマー</td><td> VWR </td><td> 62344-641 </td><td></td></tr></tbody></table>

覚醒ラットにおける高インスリン血症、正常血糖クランプ

Hyperinsulinemic-Euglycemic Clamp in the Conscious Rat

2型糖尿病（T2D）が急速に罹患率が高まっています。不十分なインスリンの生産や高血糖のレベルでインスリン生産、T2D結果を利用することができないことのいずれかによって特徴付け。インスリン感受性を評価する&quot;ゴールドスタンダード&quot;は高インスリン血症、正常血糖クランプまたはインスリンクランプです。この手順では、インスリンは血糖値の低下、その結果一定の速度で注入する。一定のレベルで血糖値を維持するために、外因性グルコース（D50）は、静脈循環に注入される。恒常性を維持するために注入されたグルコースの量は、インスリン感受性の指標である。ここで、我々は慢性的にカテーテルを挿入、無拘束、覚醒ラットにおける基本的なクランプの手順を示しています。このモデルでは、血液が動物に最小限のストレスで収集することができます。麻酔の誘導後、正中切開が行われ、左総頸動脈と右頸静脈はカテーテルをされています。挿入されたカテーテルは、体外と確保、ヘパリン生理食塩水でフラッシュされます。動物を毎日監視体重増加で、実験の前に4〜5日で回復されている。手術前のレベルに体重を取り戻すだけの動物が実験に使用されています。実験当日、ラットを絶食させるとインスリンとD50を含むポンプに接続されています。ベースラインのグルコースは、動脈ラインから評価し、実験（血糖値）全体でベンチマークを使用されています。これに続いて、インスリンを静脈循環に一定の速度で注入する。血糖値の低下を一致させるには、D50が注入される。 D50注入速度は、取り込みの速度よりも大きい場合、グルコースの上昇が発生します。同様に、速度が全身のグルコース取り込みを一致させるには不十分な場合、ドロップが発生します。安定した血糖測定値が達成されるまでグルコースの滴定は継続。この安定した期間中の血糖値およびグルコース注入率を記録し、報告されている。結果は、全身のインスリン感受性のインデックスを提供しています。技術は特定の実験的な要件を満たすように改良できます。それは組織特異的インスリン刺激によるグルコース取り込みだけでなく、全身のブドウ糖の代謝回転を決定することができる放射性トレーサーの使用によってさらに強化されています。

高インスリン血症、正常血糖クランプは、インスリン作用の評価のための&quot;ゴールドスタンダード&quot;です。インスリンはグルコース取り込みを刺激する一定の速度で注入する。このドロップダウンに対抗するために注入された外因性グルコースの量は、インスリン感受性の指標である。ここで手順は意識、無拘束のラットで実行されます。

2型糖尿病（T2D）の有病率は急速に上昇しています。インスリン分泌の不足、あるいは分泌されたインスリンを適切に利用できないことによって特徴づけられる...

この手順の全体的な目的は、意識下で拘束されていないラットのインスリン感受性を評価することです。これは、まず左総頸動脈にカテーテルを留置し、次に最適な結果を得るために右頸静脈にカテーテルを留置することによって達成されます。術後5日間の回復期間中、開通性を維持するためにカテーテルを毎日フラッシュします。最終的に、高インスリン血症正常血糖クランプ法により、全身のグルコース注入率に関する結果を得ることができます。この手法の主な利点は、高い生理学的インスリン濃度において、全身のグルコース処理率を直接測定できることです。動脈および静脈カテーテルは、手術 procedure の前に準備しておく必要があります。カテーテルの先端は鈍端とし、ヘパリン生理食塩水で満たし、エタノール滅菌を行います。また、固定用のビーズを、動脈カテーテルの場合は端から 2.7 cm、静脈カテーテルの場合は 3.2 cm の位置にしっかりと取り付けておきます。本手順では、体重約 300 g の成体雄 Sprague-Dawley ラットを使用します。動物の開始時の体重を記録し、この体重を用いて術後の体重増加をモニタリングします。無菌的な手術区域で作業を行います。ラットを麻酔ボックスに入れ、3% isof fluorineで麻酔をかけます。動物を術野から移動させ、首と肩の周囲の毛を除去して切開部位を準備します。除毛後、動物をノーズコーンにセットし、約2%のisof fluorineで麻酔を維持します。動物を手術台に固定してください。足または目の反射を確認し、ラットが完全に麻酔されていることを確認します。切開部位を70% ethanolで洗浄し、続いてBetadineで擦式消毒を行い、再度70% ethanolで洗浄します。手順の最初のステップとして、胸骨から10 millimeter上方に小さな垂直正中切開を加えます。曲がったマイクロ解剖用ピンセットを使用して組織を鈍的に剥離し、左胸骨乳突筋を露出させます。この筋肉を翻転させ、左総頸動脈を約1 cm露出させます。頸動脈の下にマイクロ解剖用ピンセットを置いて固定し、結合組織を慎重に除去します。動脈と神経の両方を損傷させることなく、迷走神経を動脈から分離することが重要です。滅菌済みの4-0シルク縫合糸を使用して頭側端を結紮します。その後、鋸歯状のマイクロ解剖鉗子で血管をクランプします。結紮した部位を穿刺します。21ゲージの静脈注入マルチサンプルルアーアダプターを使用してください。カテーテルからステンレス製プラグを取り外し、滅菌済みカテーテル導入器を用いて動脈内に誘導します。鉗子を使用して、カテーテルが固定されていることを確認します。部分的にマイクロ解剖鉗子を離し、動脈をクランプしながら、ビーズの位置までカテーテルを挿入し続けます。この時点で、カテーテルの先端

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医学

意識、無拘束マウスにおける高インスリン血症、正常血糖クランプ

ラットにおけるグルコースとイントラリピッドの慢性的な注入のためのプロトコルが記載されている。このモデルは、臓器機能および生理学的パラメータに対する過剰な栄養素の影響を研究するために使用することができる。...

ラットにおける慢性栄養注入のモデル

インスリン依存性血管拡張筋の血流を調節するなり、微小血管表面積 (微小血管募集)...

インスリン依存性血管拡張や筋肉の血流を研究する生体顕微鏡観察とマウスの後肢の造影超音波検査

このプロトコルは、マイクロ浸透圧ポンプ脳輸液システムを使用してマウスの脳に拮抗、 MetCCL5 を提供することによって視床下部におけるケモカイン (C C モチーフ) リガンド 5 (CCL5) の役割を研究します。CCL5 活動のこの一時的な抑制は、視床下部のインスリン...

マウスの脳内へ連続的な薬剤注入システムと末梢グルコース不耐症に視床下部のインスリン シグナルを勉強

高血糖クランプは、より高い血糖濃度を維持してインスリン放出を測定するために使用されます。血糖降下クランプは、逆調節反応によって誘発されるグルコース産生を測定するためのものです。どちらの方法も同じ外科的処置を使用します。ここでは、全身のグルコース代謝を評価するためのクランプ技術を紹介します。...

意識のあるマウスにおける高血糖クランプと低血糖クランプ

肺は全身気管支動脈と肺動脈の両方によって灌流される。ほとんどの肺の病変では、堅牢な血管新生を示す小さい全身の血管系である。肺血流の停止は好調気管支血管新生を促進する。我々は気管支血管新生を促進し、左肺動脈の虚血を誘導手術の詳細を提供します。...

虚血ラットの肺の血管新生

本論文では、エルバックス40Wは成体ラットの網膜への薬物送達のための徐放方法として使用することができる方法を詳しく説明します。調製ローディング、および眼への薬剤 - 樹脂複合体を送達するためのプロトコルが記載されている。...

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血行動態の測定、輸液の提供、採血のための血管アクセスは、小動物モデル研究にとって重要です。麻酔をかけたラットの頸動脈と総頸静脈にカテーテルを埋め込み、システムに接続してモニタリング、注入、サンプリングを行う技術を紹介します。...

配慮ラットモデルにおける血行動態の措置、煎茶や血液サンプリングを実行するために頸動脈と頸静脈のカテーテル

糸球体濾過率(GFR)の決定は、全体的な腎機能を評価するためのゴールドスタンダードです。しかし、このパラメータを測定する従来の手順は面倒で、多額の時間を費やす必要があります。ここでは、GFRを経皮的に測定するためのより迅速で低侵襲な方法について説明します。...

コンシャスげっ歯類における腎機能の経皮評価

私たちは、ラットの肝臓線維症の動物モデルを作成する方法を説明し、肝臓の組織学的検査によって線維化の程度を評価します。このモデルは、肝疾患の発症を研究するためだけでなく、潜在的な抗線維化剤の有効性をテストするためにも使用できます。...

ラットにおけるジメチルニトロソアミン誘発性肝線維症モデル

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覚醒ラットにおける高インスリン血症、正常血糖クランプ

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