Isolamento mitocondrial do músculo esquelético
30 de março de 2011
Este protocolo descreve um procedimento para estudar a respiração das mitocôndrias isoladas dos músculos esqueléticos. Este método foi adaptado de Scorrano Et al. (2007). O procedimento de isolamento mitocondrial requer cerca de 2 horas. A respiração mitocondrial pode ser concluído em cerca de 1 hora.
O objetivo geral deste procedimento é isolar mitocôndrias e realizar a respiração mitocondrial. Isso é realizado primeiramente isolando músculo esquelético de ratos spray dly. Em seguida, o músculo é homogeneizado e as mitocôndrias são isoladas por centrifugação.
A concentração de proteína é então determinada utilizando o ensaio de Bradford. Por fim, a respiração mitocondrial é medida por poligrafia. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o consumo de oxigênio através dos diferentes estados da respiração mitocondrial.
Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do músculo esquelético, como o efeito de diferentes intervenções na função mitocondrial. Embora este método possa fornecer informações sobre o metabolismo do músculo esquelético, ele também pode ser aplicado a outros órgãos, como fígado, cérebro, rim ou praticamente qualquer tecido antes do início do procedimento. Para isolar o músculo esquelético, prepare as seguintes soluções: P-B-S-P-B-S mais 10 milimolares de EDTA, oito vezes o tampão de isolamento de mitocôndrias, tampão de isolamento um ou IB um, tampão de isolamento dois ou IB dois e tampão experimental ou eb.
Consulte o protocolo escrito acompanhante para obter instruções. Em seguida, ligue a centrífuga e ajuste-a para quatro graus Celsius. Ligue um banho-maria e ajuste-o para 37 graus Celsius.
Em um balde com gelo, coloque três béqueres de 10 mililitros, um homogeneizador de Potter-Elvehjem, trituradores de tecido para gemas, tesouras cirúrgicas pequenas e 10 tubos de microcentrífuga. Tudo deve permanecer gelado durante todo o experimento. Coloque o IB um e o IB dois no gelo e o EB em banho-maria morno.
Em seguida, adicione as seguintes soluções aos três béqueres sobre gelo: béquer um, 10 mililitros de PBS; béquer dois, 10 mililitros de P-B-S-E-D-T-A; béquer três, três mililitros de ib. Um, eutanazie uma rata de acordo com os procedimentos aprovados pelo comitê institucional local de cuidados com animais.
Em seguida, isole rapidamente 250 a 500 miligramas de músculo esquelético com pinça e tesoura Mayo Clinic. Enxágue-o no béquer um, depois transfira-o para o béquer dois, para homogeneizar o músculo. Primeiro, transfira-o para o béquer três e, finalmente, pique-o com a tesoura.
Transfira a solução para o homogeneizador Potter-Elvehjem e homogeneíze o músculo usando um pistilo motorizado 10 vezes, mantendo o tubo sempre em gelo. Em seguida, transfira o homogeneizado para tubos de microcentrífuga de dois mililitros previamente resfriados e centrifugue a 700 ×g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante S para um novo tubo de microcentrífuga previamente etiquetado e descarte o pellet da centrifugação.
O sobrenadante S a 10.500 Gs durante 10 minutos a quatro graus Celsius, transfira o SNAT para um novo tubo de microcentrífuga pré-preenchido e rotule-o com SN um e tipo muscular Reese. Suspenda o precipitado em 500 microlitros de IB dois, depois centrifugue a 10.500 Gs durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga pré-preenchido e rotule-o com SN dois e tipo muscular.
Suspenda o pellet mitocondrial final em 100 microlitros do IB dois. Gire em uma mini centrífuga por alguns segundos. Se houver um pellet, transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga pré-preenchido e descarte o pellet. A calibração do eletrodo de oxigênio é uma etapa fundamental neste protocolo e deve ser realizada diariamente.
A calibração do eletrodo pode ser concluída durante o isolamento mitocondrial. Para começar, adicione 100 mililitros de água destilada a um frasco de 250 mililitros e agite vigorosamente por 20 minutos. Para equilibrar a água com o gás atmosférico, cubra o eletrodo GRAT com algumas gotas de cloreto de potássio a 50%.
Em seguida, coloque um pequeno pedaço de papel de enrolar azul Rizla sobre o eletrodo. Depois, um pedaço de membrana de PTFE sobre o papel de enrolar.
Aplicar o anel interno utilizando o aplicador de anel e, em seguida, colocar o anel externo no sulco do eletrodo. Conectar os eletrodos e montar a base do anel plástico maior, a câmara mitocondrial e as mangueiras de água. Ligar as caixas GRAT e iniciar o software GRAS.
Adicione a água equilibrada à câmara mitocondrial. Em seguida, adicione um bastão de agitação para ligar o agitador. Clique em hardware.
Em seguida, agite em uma velocidade. Ajuste a velocidade para 60 e clique em iniciar. A seguir, comece um novo experimento.
Clique em calibrar e, em seguida, em calibração da fase líquida. Para a caixa um, altere a temperatura para 37 graus Celsius e clique em ok duas vezes. Quando a substituição mudar para ok, clique nela e abra o tanque de gás nitrogênio.
Coloque a ponteira conectada ao tanque de nitrogênio na câmara e estabeleça oxigênio zero. Clique em ok quando a tela mudar de override. Aspire a água e adicione 500 microlitros de EB às câmaras mitocondriais.
Feche a câmara com um êmbolo. Se estiver usando várias caixas, repita a partir da etapa de calibração para cada caixa. Inicie um novo experimento e deixe-o rodar por cerca de um minuto.
Para estabilizar o sinal, adicione o volume necessário da suspensão de mitocôndrias para atingir 150 microgramas em cada câmara. Marque o evento e deixe rodar. Durante um minuto, adicione 10 microlitros de glutamato 250 milimolar morno, malato 125 milimolar para uma concentração final de cinco milimolar de glutamato, 2,5 milimolar de malato, marque e deixe rodar por um minuto.
Isso é definido como estado dois. Em seguida, adicione 7,5 µL de DP 10 milimolar para uma concentração final de 150 micromolar. Depois marque e deixe rodar por 30 segundos.
Isso é definido como estado três. Adicione mais 7,5 microlitros de DP 10 milimolar, marque, e deixe rodar por 1,5 minuto. Adicione 0,5 microlitro de oligomicina 10 milimolar fria para uma concentração final de um micromolar, marque, e deixe rodar por três minutos.
Isso é definido como estado quatro. Adicione um microlitro de FCCP frio, 0,1 milimolar, para uma concentração final de 0,2 micromolar, e deixe RUM por três minutos. Isso é definido como estado cinco.
Quando terminar, finalize o experimento e salve-o. Adquira as taxas de respiração utilizando o software raft. Insira o fator de normalização.
Se estiver adicionando 150 microgramas de proteína mitocondrial, o fator de normalização será 0,15. Calcule as taxas de respiração normalizadas para os diferentes estados respiratórios. Calcule a razão de controle respiratório ou RCR dividindo o estado três pelo estado quatro.
Esta figura mostra um traçado representativo do consumo de oxigênio por mitocôndrias do músculo esquelético. Após a estabilização do sinal do eletrodo, a amostra de mitocôndrias é adicionada à câmara GRAT. A respiração no estado dois inicia-se com a adição de glutamato e malato.
A adição de ADP aumenta o consumo de oxigênio. Definição do estado três. A respiração ocorre quando a ATP sintase é bloqueada pela adição de oligomicina para obter a respiração no estado quatro.
Finalmente, FCCP é adicionado para desacoplar a respiração mitocondrial. Este diagrama mostra as taxas representativas de consumo de oxigênio para os estados 2, 3, 4 e cinco. A razão de controle respiratório ou RCR é calculada para cada experimento.
Um RCR superior a quatro é considerado evidência de um preparo viável de mitocôndrias. Durante a tentativa deste procedimento, é importante manter as amostras de mitocôndrias sempre em gelo. Após a realização deste procedimento.
Outros métodos, como blotagens Western, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o conteúdo de proteínas mitocondriais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar mitocôndrias de músculo esquelético, bem como da respiração mitocondrial.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um procedimento para isolar mitocôndrias de músculos esqueléticos e medir sua respiração. O método permite a avaliação da função mitocondrial por meio da análise do consumo de oxigênio.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Metabolismo
Contexto
- As mitocôndrias desempenham um papel crucial na produção de energia.
- Compreender a respiração mitocondrial é essencial para o estudo de distúrbios metabólicos.
- Este protocolo é adaptado de metodologias estabelecidas.
- O isolamento de mitocôndrias é fundamental para a medição precisa de sua função.
Objetivo do Estudo
- Isolar mitocôndrias de tecido muscular esquelético.
- Medir as taxas de respiração mitocondrial.
- Analisar o consumo de oxigênio em diferentes estados de respiração mitocondrial.
Métodos Utilizados
- Isolamento de músculo esquelético de ratos submetidos à secagem por aspersão.
- Homogeneização do tecido muscular.
- Centrifugação para isolamento de mitocôndrias.
- Determinação da concentração de proteína utilizando o ensaio de Bradford.
- Medição da respiração mitocondrial utilizando poligrafia.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de mitocôndrias do músculo esquelético.
- Avaliação quantitativa da respiração mitocondrial.
- Os resultados indicam consumo variável de oxigênio entre diferentes estados respiratórios.
Conclusões
- O protocolo isola efetivamente mitocôndrias para estudos de respiração.
- Os achados contribuem para a compreensão da função mitocondrial em processos metabólicos.
- Este método pode ser aplicado em pesquisas futuras sobre metabolismo muscular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de mitocôndrias funcionais do músculo esquelético permite a eliminação mecanicista de riscos associados a alvos metabólicos na fase pré-clínica de descoberta. Leituras quantitativas da respiração fornecem confiança preditiva para a validação de alvos e investigação de vias metabólicas. Este método apóia decisões precoces de avançar ou interromper projetos, estabelecendo limiares de viabilidade mitocondrial antes da triagem de compostos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao relacionar a função mitocondrial com o metabolismo do músculo esquelético e a homeostase energética.
- Valor Operacional: Permite a desconsideração de riscos biológicos mediante o isolamento padronizado de mitocôndrias viáveis com RCR ≥4 como referência funcional.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao quantificar razões de controle respiratório que refletem a integridade mitocondrial e a eficiência de acoplamento.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas mitocondriais validados para ensaios bioquímicos e funcionais posteriores, incluindo atividade enzimática e proteômica.
- Valor Operacional: Garante a padronização dos ensaios mediante calibração diária do eletrodo de oxigênio e normalização consistente de proteínas utilizando o ensaio de Bradford.
- Valor de Escalabilidade: Permite a avaliação confiável de compostos por meio de medições reprodutíveis da respiração nos estados 2-5 sob condições controladas de substrato e inibidor.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a relevância para doenças ao estudar a respiração mitocondrial no músculo esquelético, um tecido-chave nos distúrbios metabólicos.
- Valor Operacional: Fornece continuidade translacional, desde a descoberta até a validação pré-clínica, por meio do consumo quantitativo de oxigênio em diferentes estados respiratórios.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões ao medir a respiração desacoplada (estado 5) e a ligada ao ATP (estado 3) para avaliar a saúde bioenergética.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta que vai do teste de hipóteses à identificação de compostos líderes, apoiando programas direcionados às mitocôndrias em doenças metabólicas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante o isolamento de mitocôndrias para esclarecer as vias envolvidas na síntese de ATP e na sinalização metabólica.
- Triagem: Garante prontidão para ensaios por meio de medições reprodutíveis de respiração que permitem comparar os efeitos de compostos sobre o consumo de oxigênio.
- Análises: Gera leituras quantitativas (respiração nos estados 2-5, RCR) que ajudam as equipes a comparar condições e avaliar a função mitocondrial.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao fornecer dados funcionais de mitocôndrias relevantes para modelos de metabolismo muscular e de gasto energético.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável de isolamento e respiração aplicável a diversos tipos de músculo esquelético e adaptável a outros tecidos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na viabilidade mitocondrial, redução da ambiguidade mecanicista em estudos do metabolismo energético.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos ensaios de isolamento mitocondrial e de respiração.
- Valor Estratégico: Melhores decisões de prosseguir/interromper, eficiência do capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados em programas de alvos metabólicos.
- Impacto na Carteira: Priorização e tomada de decisões de avanço ajustadas ao risco, com base em razões de controle respiratório e perfis de respiração específicos por substrato.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em técnicas de isolamento mitocondrial, centrifugação e medição da respiração.
- Depende de equipamentos como homogeneizadores, centrífugas mantidas a 4°C, banhos-maria a 37°C e sistemas com eletrodo polarográfico de oxigênio.
- Requer padronização entre as equipes no preparo de tampões, calibração diária do eletrodo e manipulação rigorosa das amostras sob refrigeração com gelo.
- Considerações para adaptação incluem o ajuste da quantidade de tecido muscular (250-500 mg) e da carga proteica mitocondrial (150 µg) entre diferentes tipos de músculo esquelético.
- Limitações práticas incluem a necessidade de reagentes frescos, janela curta para estudos funcionais (~1 hr após o isolamento) e calibração diária dos eletrodos de oxigênio.
