全マウントを使用するその場でハイブリダイゼーション

この手順の全体的な目標は、発生の特定の段階でゼブラフィッシュの胚における遺伝子発現のパターンを観察することです。これは、まず標識アンチセンスリブプローブ中のジ酸素を目的のMR mRNAにハイブリダイズすることによって達成されます。2番目のステップは、リボプローブを検出することです。

doxygenに対する抗体の使用は、抗体がアルカリホスファターゼ酵素に結合しています。手順の3番目のステップは、アルカリホスファターゼ酵素と反応して不溶性の紫色の沈殿物を生成するNBTとBCIPの添加による染色です。手順の最終ステップは、十分に染色された胚をメタノールでインキュベートして、非特異的染色を減らすことです。

最終的には、発生の特定の段階でゼブラフィッシュの全胚における遺伝子発現パターンを示す結果は、全山種2のハイブリダイゼーションを使用して得ることができます。この手法は、従来の教室での組織学や解剖などの既存の方法よりも優れている点として、分子生物学と生物の発生・進化の傾向との間に概念的な架け橋を築く機会を学生に提供し、それによって真に統合的な体験を提供することができる点です。これらの方法は、伝統的に少数のモデル生物の発生を研究するために使用されてきましたが、椎骨分類群全体の発生経路の保存を理解するために、他の非モデル生物にも簡単に適用でき、これらの経路がどこで逸脱して進化の新規性につながるかを理解することができます。

この方法は学部生には馴染みがないので、最初は苦労する学生もいるかもしれませんが、この方法を学ぶことは、学部の研究経験や上位部門のコースで役立つでしょう。この手順を開始するには、移送パイプを使用して、約50個のゼブラフィッシュの胚をマイクロリダクションチューブに移します。余分な液体を取り除き、1.5ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドをチューブにピペットで移します。

胚のチューブを室温で一晩攪拌機の上に置きます。翌朝、修正を取り外して廃棄します。0.1%tween 20を含む1.5ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水を胚に加えて洗浄します。

必要に応じて、先端の細い鉗子を使用して手動で胚をコーティングし、トランスファーピペットを使用してコーティングされた胚をきれいなマイクロフューズドチューブに入れます。次に、1.5ミリリットルの25%メタノールとPBSTをチューブにピペットで入れます。1時間インキュベートした後、胚を乱さずにこの溶液をできるだけ多く吸引します。

次に、PBSTで1.5ミリリットルの50%メタノールと交換し、最低1時間インキュベートします。最後に、100%メタノールの1.5ミリリットルと交換し、摂氏マイナス20度に置きます。胚はマイナス20°Cのメタノールで保存することができます。

使用する準備ができたら、チューブからメタノールをピペットで取り出し、PBST中の50%メタノールをチューブに入れ、10分間インキュベートします。これを繰り返し、2回目に洗浄してから溶液を吸引し、PBSTで25%メタノールでインキュベーションを繰り返します。

最後に、100%PBSTでそれぞれ10分間2回洗浄し、PBSTで10%過酸化水素溶液を調製します。ゼブラフィッシュの胚をこの溶液に室温で浸し、マイクロフッドチューブキャップを開いた状態で、胚の年齢に応じて10〜20分間浸します。トランスファーピペットを使用して暗い色素沈着を除去するには、過酸化水素溶液を取り外して廃棄します。

胚を1.5ミリリットルのPBSTで複数回すすぎ、反応を止めます。PBSTでプロテイナーゼKの1ミリリットルあたり50ミリグラムの原液を5,000に希釈します。通常、4.999ミリリットルのPBSTに1マイクロリットルのプロテイナーゼKが含まれています。

胚からPBSTを取り出します。トランスファーピペットを使用して廃棄し、1.5ミリリットルのプロテイナーゼK溶液をチューブに加えます。胚を室温のプロテイナーゼK溶液に3〜15分間浸します(胚の年齢にもよりますが)。

PBSTで複数回洗浄して反応を止めます。次に、PBSTを取り出し、胚を4%パワーホルムアルデヒドに室温で30分間浸して再固定し、トランスファーピペットを使用してパラホルムアルデヒドを除去して廃棄します。胚に1.5ミリリットルのPBSTを加え、5分間洗浄します。

バイアルからPBSTを慎重にピペットで取り出し、廃棄します。さらに2容量のPBSTで洗浄を繰り返します。次に、リッププローブハイブリダイゼーション、70°Cまでの予温水浴に進み、プレハイブリダイゼーション溶液を調製します。

次に、トランスファーピペットを使用してPBSTを取り外して廃棄します。胚を0.5ミリリットルのプレハイブリダイゼーション溶液に浸し、摂氏70度の水浴中で2〜3時間インキュベートします。胚を邪魔しないように注意してください。

マイクロリフューズチューブからプレハイブリダイゼーション溶液をピペットで取り出し、廃棄します。0.5ミリリットルのハイブリダイゼーション溶液をチューブに静かにピペットで移します。次に、以前に合成したdoxygenを標識されたriboにすばやく追加します。

チューブリボプローブへのプローブは、ミリリットルあたり約1マイクログラムの範囲の濃度が使用されます。摂氏70度で一晩インキュベートします。翌日、2倍の生理食塩水クエン酸ナトリウム、2倍のSSC溶液、0.2倍のSSC溶液に75%50%と25%PHSの溶液を準備します。

摂氏70度の水浴でより多くの溶液を温めます。溶液が摂氏70度に達したら、ウォーターバスから取り出します。次に、チューブからハイブリダイゼーション溶液を吸引し、廃棄します。

各温かいP-H-S-S-S-SC溶液を0.5ミリリットル加え、各溶液中の胚を摂氏70度で10分間インキュベートします。最後に、胚を0.2倍のSSC溶液で摂氏68度で30分間インキュベートします。チューブから0.2倍のSSC溶液を吸引し、廃棄します。

胚を1.5ミリリットルのリンゴ酸緩衝液pH 7.5で室温で10分間インキュベートします。これを繰り返し、もう一度洗います。書かれたプロトコルに従ってブロッキング溶液を準備します。

MAB中の胚を12の各ウェルに移す。ウェルプレート。余分なMABを取り除き、それぞれに1〜2ミリリットルのブロッキング溶液をピペットで入れます。

で少なくとも3時間撹拌しながら十分にインキュベートします。抗体中の抗原を残りのブロッキング溶液中で2000に希釈します。穏やかな植生で室温で少なくとも3時間インキュベートします。

胚を邪魔しないように注意してください。プレートのウェルからブロッキング溶液をピペットで取り出し、廃棄します。抗体とブロッキング溶液中の抗ドキシバルをウェルに静かにピペットで移し、摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、1.5ミリリットルのリンゴ酸緩衝液の5つの交換で胚を洗浄します。胚をリンゴ酸緩衝液中で5分間インキュベートします。まず、バッファー交換を行い、10分間2回インキュベー

30分間隔と60分間隔の1つ。ウェルからのmeic酸緩衝液の最終洗浄を吸引し、ピペットを廃棄します。1.5〜2ミリリットルのアルカリホスファターゼ緩衝液をウェルに注入し、5分間インキュベートします。

このプロセスを 2 回繰り返します。アルカリホスファターゼ緩衝液を除去し、1.5〜2ミリリットルの染色溶液をウェルに加えます。プレート全体をアルミホイルで包み、光から保護し、20分間隔で静かに攪拌します。

撹拌を止め、解剖顕微鏡で胚を観察し、十分な染色が達成されたかどうかを確認します。十分な染色が見られたら、ウェルから染色溶液をピペットで取り出して廃棄します。PBSTと交換して、染色反応を停止します。

PBSTの別の容量で洗浄プロセスを繰り返し、井戸からPBSTをピペットでピペットし、胚を脱水するために廃棄しますPBST中の25%メタノールの1.5〜2ミリリットルを井戸にピペットし、10分間インキュベートします。50%メタノールをPBST中で2回繰り返し、各洗浄でさらに10分間繰り返します。次に、胚を100%メタノールに移し、少なくとも2時間インキュベートして非特異的染色を減らします。

インキュベーション後、ウェルからメタノールをピペットで取り出し、廃棄して胚を再水和します。50%メタノールをPBSTで2回洗浄し、続いて25%メタノールをPBSTでそれぞれ10分間洗浄します。その後、100%PBSTを毎回10分間、2回洗浄します。

最後に、染色した胚をPBSTの80%グリセロール溶液に段階的な一連の洗浄液を用いて移し、正しく観察されるまで摂氏4度で保存します。目的の遺伝子の発現は、ゼブラフィッシュの胚に紫色の染みが現れることによって示されます。この画像は、パーソナライゼーションの24時間後のゼブラフィッシュの胚を示しています。これは、AAL DH oneに特異的なRIBAプローブとハイブリダイズされています。これは、目、後脳、胸筋、ひれ芽、ria、および体節に特異的な染色が見られます。

この画像は、発生の13体節段階にあるゼブラフィッシュの胚を、この場合 A.In FGF8に特異的なプローブと交配したものです。tline kelon、背側Dion、Kelon中脳、後脳境界、体節、尾芽に特異的な染色が見られる。この画像は、受精後22時間のゼブラフィッシュ胚を、神経系の可視化に有用なPAX two A.A強固なマーカーに特異的なプローブと交配

特異的な染色は、脈絡膜裂傷、中脳、後脳境界、耳小胞、および脊髄ニューロンに見られると、習得されます。この手法は、コースのスケジュールに応じて、複数の研究室セッションで実施するように変更することができます。教室の外での時間と労力は、インストラクターによって必要になる場合があります。

このビデオを見た後、ホールマウントとC twoハイブリダイゼーションを学部の研究室に持ち込むという考えに慣れていただければ幸いです。学生がこれらのスキルを身に付けるにつれて、この手法について知ることで、上位部門または大学院の研究経験への移行が容易になります。