Dissection et 2-Photon Imaging des ganglions lymphatiques périphériques chez les souris

Bonjour, je m’appelle Melanie Matthew. Je viens du laboratoire de Micah Helen à l’Université de Californie à Irvine. Et aujourd’hui, nous allons prélever des ganglions lymphatiques d’une souris à des fins d’imagerie in situ à photons.

Cela implique l’ablation des ganglions lymphatiques inguinaux, des ganglions lymphatiques axillaires et des ganglions lymphatiques cervicaux. Les six ganglions lymphatiques périphériques faciles d’accès chez une souris Pour obtenir des cellules fluorescentes dans nos ganglions lymphatiques de souris. Pour imager via l’imagerie à deux niveaux, nous devons d’abord effectuer un transfert adoptif de cellules marquées par fluorescence.

Donc, pour cette expérience, je vais d’abord vous montrer le transfert adoptif. Voici donc notre seringue à insuline de calibre 28. Je vais le charger avec quelques cellules ou cellules.

D’abord, je veux détacher la seringue pour qu’elle vole facilement. Et je vais soigneusement charger les cellules. Je vais faire de mon mieux pour ne pas toucher les côtés du tube avec la seringue à insuline, car cela émousserait la seringue et rendrait plus difficile l’injection dans la veine de la queue de souris.

S’il y a des bulles d’air, vous devez les expulser, en quelque sorte, les écarter. Sortez-les du chemin ici. Alors nous y voilà.

Nous sommes maintenant prêts à injecter ces cellules dans la veine de la queue. D’accord, voici donc notre souris C 57 black six. Nous allons la faire reculer lentement et doucement dans l’injecteur de veine de la queue.

Beaucoup de souris n’aiment pas cela, mais cela les empêche de sauter lorsque vous faites l’injection et de se blesser davantage, ou vous obtenez éventuellement une piqûre d’aiguille. Donc, vous fixez très lentement la souris à l’intérieur. Et maintenant, vous cherchez la veine de la queue le long des côtés de la souris, la queue de la souris.

Ainsi, une grande artère longe le sommet. Et puis de chaque côté de la queue de la souris, il y a deux belles longues veines. Descendez jusqu’à la pointe.

Alors vous prenez votre aiguille et vous commencez bas sur la queue et vous cherchez une veine. Donc, je peux voir juste là, il y a une veine. Je vais le mouiller un peu avec de l’éthanol, cela peut le rendre un peu plus clair à voir.

D’accord, maintenant nous allons injecter la veine de la queue et il est important de garder le biseau de l’aiguille vers le haut. C’est l’extrémité ouverte de l’aiguille vers le haut. Et de se déplacer presque parallèlement à la queue.

Vous ne voulez pas aller dans un angle parce que les veines sont juste au-dessus. Vous voulez juste glisser l’aiguille dans la veine de la queue très lentement. Et au fur et à mesure que vous faites cela, vous devriez être en mesure de le sentir entrer avec un peu plus d’expérience.

Mais les deux premières fois, vous voulez pousser le liquide et voir s’il y a une résistance. S’il n’y a pas de résistance, vous êtes dans la veine de la queue et vous pouvez faire une injection rapide et facile comme ce que je viens de faire en ce moment. Ensuite, vous pouvez retirer lentement l’aiguille.

Une autre confirmation que vous êtes dans la veine est que vous aurez une petite goutte de sang du reflux. Donc, avoir un bon reflux de sang sortant de votre site d’injection juste un peu confirmera que vous étiez bien dans la veine de la queue. Et la souris devrait cesser de saigner peu de temps après votre injection.

D’accord, voici donc notre souris noire six Et nous allons retirer les ganglions lymphatiques de la souris des flancs inguinaux, qui sont ici, ici sous l’aisselle, c’est là que vous trouvez vos ganglions axillaires ici. Et de l’autre côté ici. Et puis les ganglions cervicaux superficiels, qui sont ici dans la gorge là et là, un de chaque côté.

Hi.So maintenant, nous sommes prêts à disséquer notre souris. Et je vais commencer par épingler la souris sur le tableau, ici sur le tableau de dissection. Et allez-y et épinglez la pause. Oui.

Vous voulez vous assurer qu’il s’agit d’une tâche d’épinglage sécurisée. Cela nous permettra de mieux exposer les ganglions lymphatiques périphériques. Donc, en général, je coince les quatre pattes vers le bas.

Je ne m’inquiète pas de la queue. Certaines personnes aiment aussi épingler la queue. Et puis, pour empêcher la fourrure d’aller dans la région où nous disséquons et de se répandre sur nos ganglions lymphatiques et nos instruments, nous vaporisons la souris avec de l’éthanol à 70 %.

Et maintenant que la souris est désherbée avec de l’éthanol, je vais faire une incision de la ligne médiane. Et je le fais en tirant la fourrure loin du corps. La peau, vous pouvez la voir, je peux la tirer et faire une petite tente.

Et cela vous évitera de couper le péritoine, ce que vous ne voulez pas faire dans ce cas. D’accord, je vais donc commencer par mon incision médiane ici. Je fais une petite incision et je m’assure que je ne suis pas dans le péritoine.

Vous pouvez voir qu’il y a le péritoine en dessous. Je glisse mes ciseaux sous la coupure et je me fraye lentement un chemin en séparant la peau du péritoine, en faisant de petites coupures au fur et à mesure parce que nous allons prendre les ganglions lymphatiques cervicaux. Je vais couper jusqu’à la mâchoire de la souris très soigneusement et lentement en m’assurant de ne pas heurter de vaisseaux sanguins majeurs.

Ensuite, parce que nous prenons les ganglions lymphatiques inguinaux, qui se trouvent dans la partie inférieure du lambeau de peau, je vais faire une incision médiane jusqu’à environ la queue, la base de la queue à cet endroit. Alors voilà. Il y a une incision médiane pour nous qui fonctionnera.

Maintenant, je vais séparer la peau du péritoine. Je vais le faire doucement avec des pinces en retirant la peau du péritoine au fur et à mesure. Et j’expose le premier ganglion lymphatique que nous allons disséquer.

Il s’agit du ganglion lymphatique inguinal situé ici, dans le lambeau cutané inférieur. Donc, maintenant que j’ai retiré un lambeau de peau du corps principal de la souris, je vais le coincer pour exposer le ganglion lymphatique inguinal. C’est donc une meilleure exposition du ganglion lymphatique inguinal, ce qui nous permettra de le disséquer proprement.

Nous avons donc ici le ganglion lymphatique inguinal exposé après l’épinglage. Il se trouve généralement dans le lambeau de peau, juste au-dessus de la jambe ici. Et c’est, vous pouvez le trouver en regardant la jonction en forme de Y des vaisseaux sanguins qui passent au-dessus.

Et voilà. Il est rentré avec un peu de graisse et les vaisseaux sanguins qui coulent sur le dessus. Très bien, maintenant je vais enlever le ganglion lymphatique inguinal.

J’effleure ma pince de chaque côté du ganglion lymphatique pour l’éloigner de la graisse. Nous ne voulons pas de graisse. Avec notre imagerie à deux photons, il obscurcira la pénétration laser du tissu.

Voyons. Il est important d’enlever toute la graisse pour le ganglion lymphatique ainsi que de garder le cortex du ganglion lymphatique intact. D’accord, nous y voilà.

Voici donc notre ganglion lymphatique d’Iena. Je vais le placer dans nos médias et la bonne façon de savoir si vous avez enlevé toute la graisse est si le ganglion lymphatique coule. Une fois que vous l’aurez mis dans le support, il coulera jusqu’au fond.

S’il y a de la graisse, elle flottera. Très bien, maintenant je vais enlever le ganglion lymphatique auxiliaire. Il est situé dans l’aisselle de la souris, le long d’un vaisseau sanguin majeur.

Donc, parfois, cela peut être délicat car vous aurez beaucoup de saignements qui obscurcissent le nœud. Mais je vais vous montrer ce que je fais et j’espère que nous n’aurons pas de saignement cette fois-ci. Donc, j’ai d’abord démonté le lambeau de peau, et j’ai en fait désinséré cet avant-bras à côté du nœud que je veux prendre.

Cela me permet d’éloigner la peau avec plus de dextérité à l’aide de mes doigts, mais tenez ce muscle qui passe sur l’aisselle et celui-ci devrait sortir du nœud axillaire avec une légère traction. Et je vais le chercher tout de suite. Et voilà.

C’est juste là, dans l’aisselle, le long d’un vaisseau sanguin majeur. Alors maintenant, je vais disséquer le nœud axillaire et vous pouvez réépingler la peau ou vous pouvez la tenir avec vos doigts, selon ce qui vous convient le mieux. Mais j’aime travailler avec soin avec ça.

Il y a très peu de graisse autour de ce ganglion lymphatique, ce qui le rend agréable pour l’imagerie, mais il se trouve à côté d’un vaisseau sanguin majeur, vous pouvez donc les perdre parfois si vous ne faites pas attention. Donc, pour le nœud axillaire, je saisis le tissu conjonctif qui l’entoure et je le sépare lentement des vaisseaux sanguins. Et d’accord, et c’est parti.

Il y a notre nœud axillaire. Donc c’est juste là. C’est un beau ganglion lymphatique long et plat.

Et je saisis un peu de tissu conjonctif laissé sur le côté du nœud afin de ne pas endommager le nœud lui-même. Nous allons faire une image pour garder les ganglions lymphatiques hydratés. Avant de faire l’imagerie de notre institut, nous les plaçons dans des milieux indépendants du CO2 dans des chambres individuelles afin de pouvoir suivre les ganglions lymphatiques inguinaux, axillaires et cervicaux.

La façon dont vous pouvez savoir si vous avez fait une bonne préparation des ganglions lymphatiques est de savoir s’il coulera au fond après l’avoir disséqué. Cela signifie qu’il y a très peu de graisse dans le ganglion lymphatique. D’accord, maintenant je vais enlever le ganglion lymphatique cervical, cervical superficiel.

Et je fais cela, je commence par réépingler à partir du moment où j’ai enlevé le nœud axillaire, j’expose un peu mieux le tissu cervical. Et les ganglions lymphatiques cervicaux se trouvent près des muscles de la mâchoire de la souris. En fait, sur le côté.

Ce sont les mêmes ganglions lymphatiques que vous pouvez sentir lorsque vous tombez malade. Ce sont ceux que votre médecin recherchera si vous avez un rhume de tête. Et pour ce faire, j’aime généralement mettre mon doigt sous le tissu pour le tirer vers l’avant pendant que j’effleure mes pinces sur le côté.

Je devrais avoir un ganglion lymphatique qui sort. Oh, c’est là. C’est là-haut dans les tissus.

Voilà. Il y a donc un ganglion cervical superficiel. Vous devez faire attention à ne pas prendre de glandes salivaires.

Vous ne trouverez pas de cellules T dans vos glandes salivaires. Et ces ganglions lymphatiques particuliers ont des lymphocytes T CD quatre positifs marqués avec CFSC en eux. Nous allons donc vous montrer quelques vidéos in situ de ces cellules T se déplaçant dans les tissus.

D’accord, maintenant je vais coller le ganglion lymphatique sur une lamelle en plastique incassable afin que nous puissions le fixer au bas de notre étape d’imagerie in situ. De cette façon, nous n’aurons pas de mouvement ou de dérive tissulaire pendant que nous imaginons les lymphocytes T. J’ai donc ici mes capots en plastique incassables.

La première chose que je vais faire est de couper l’un d’entre eux à la bonne taille pour notre ganglion lymphatique. Alors je prends juste mes ciseaux et j’ai coupé un petit carré Ici. D’accord, maintenant je vais tamponner de la colle dessus.

C’est un peu de colle. Étalez-le autour de la pièce de diapositive que nous avons coupée. Ensuite, je vais prendre une lingette Kim et enlever un peu de colle.

C’est de la colle qui recouvrira le nœud. Nous voulons juste une couche très fine pour ne pas obscurcir l’imagerie. Je vais ensuite retirer un ganglion lymphatique de la solution.

Nous allons donc commencer par notre premier ganglion lymphatique ici hors des médias. Vous voulez être doux avec cela. Vous ne voulez pas endommager le cortex du nœud.

Je vais saisir juste le coin de celui-ci et le coller sur la lame en touchant doucement le coin du ganglion lymphatique jusqu’à la lame d’abord, puis en tirant le ganglion lymphatique sur la lame, en le fixant à la lame. J’ai donc utilisé ce tout petit peu de graisse qui était laissée sur le bord du ganglion lymphatique pour le faire. Donc, en fait, je ne perturbe pas le cortex du nœud.

Je prends ensuite le ganglion lymphatique et maintenant, pour durcir la colle, je vais la tremper dans le même puits que j’ai retiré. Je vais donc le retourner et le tremper doucement dans le support en portant toute la colle. Enlevez un peu de l’exo colle qui a durci avec.

Et voilà. Maintenant, nous avons un ganglion lymphatique préparé pour l’imagerie à deux photons. C’est ainsi que vous préparez les ganglions lymphatiques pour l’imagerie in situ à deux photons.

Maintenant, nous allons les amener à notre microscope, le configurer et obtenir de superbes images des lymphocytes T que nous avons transférés par adoption. Nous avons donc ici des lymphocytes T marqués CFSE se déplaçant à l’intérieur d’un ganglion lymphatique inguinal. Cette vidéo est accélérée environ 500 fois et vous pouvez voir que les cellules sont très mobiles.

Ils sont amplifiés d’environ 20 fois avec notre objectif de trempage dans l’eau 20 fois. Ce n’est qu’un exemple du mouvement des lymphocytes T uniquement. Nous n’avons rien fait pour colorer les cellules environnantes.

Généralement, dans deux expériences photo plus avancées, vous pouvez avoir des cellules dendritiques colorées, des cellules B colorées et des cellules T interagissant avec des cellules NK colorées. Vous pouvez étiqueter à peu près n’importe quel type de cellule que vous vous attendez à voir à l’intérieur du ganglion lymphatique et aller de l’avant et l’imager. Voilà donc pour le protocole d’imagerie des ganglions lymphatiques de notre institut.