解剖とマウスの末梢リンパ節の2 - フォトンイメージング

こんにちは、私の名前はメラニー・マシューです。私はカリフォルニア大学アーバイン校のマイカ・ヘレンの研究室の出身です。そして今日は、マウスからリンパ節を採取し、その場で光子イメージングを行います。

これには、鼠径リンパ節、腋窩リンパ節、および頸部リンパ節の切除が含まれます。マウスで簡単にアクセスできる6つの末梢リンパ節 蛍光細胞をマウスリンパ節に取り込むため。2つのボットンイメージングでイメージングするには、まず蛍光標識細胞の養子移植を行う必要があります。

そこで、この実験では、まず養子縁組の譲渡をお見せします。だからこれが私たちの28ゲージのインスリン注射器です。私はそれをいくつかの細胞または細胞でロードするつもりです。

まず、注射器が飛んでくるように止めたり外したいと思います。そして、セルを丁寧にロードしていきます。インスリン注射器でチューブの側面に触れないように最善を尽くします。なぜなら、注射器が鈍くなり、マウスの尾静脈への注射が難しくなるからです。

気泡がある場合は、気泡をはじき飛ばして、邪魔にならないようにする必要があります。ここでそれらをタップしてください。というわけで、私たちはそこにいます。

これで、これらの細胞を尾静脈に注入する準備が整いました。さて、これが私たちのC 57ブラックシックスマウスです。彼女をゆっくりと優しく尾静脈インジェクターに戻します。

多くのマウスはこれを好みませんが、実際の注射を行っているときに飛び跳ねて自分自身を傷つけたり、針が刺さったりするのを防ぐことができます。だから、あなたはただ非常にゆっくりとマウスを内部に固定します。そして今、あなたはマウスの側面に沿って尾静脈、マウスの尾を探します。

そのため、上部には大きな動脈が走っています。そして、ネズミの尻尾の両側には、2つの素敵な長い静脈があります。先端までずっと下がっていきます。

そこで、針を取って、尾の低い位置から始めて、静脈を探します。だから、そこに静脈があるのが見えます。エタノールで少しだけ濡らすと、少しはっきりと見えます。

さて、では尾静脈を注入するのですが、針の斜角側を上にしておくことが重要です。それは針の端が開いたです。そして、尾とほぼ平行に移動します。

静脈が真上にあるため、角度をつけたくありません。針を尾静脈に非常にゆっくりと滑らせたいだけです。そうすることで、もう少し経験を積むことで、それが入ってくるのを感じることができるはずです。

しかし、最初の数回は、液体を押して抵抗があるかどうかを確認します。抵抗がなければ、尾静脈に入っており、私が今やったように、素早く簡単に注射をすることができます。その後、ゆっくりと針を引き抜くことができます。

あなたが静脈の中にいるもう一つの確認は、逆流から少し血が流れていることです。ですから、注射部位から少しだけ血液が逆流していることで、間違いなく尾静脈にいたことが確認できるのです。そして、マウスはあなたの注射後すぐに出血を止めるはずです。

さて、これが私たちの黒い6匹のマウスです そして、マウスのリンパ節を鼠径部の側面から取り除きます。これはここ、ここ、ここ、腋窩節がある場所です。そして、反対側はこちら。そして、表在性の頸部リンパ節は、喉のあちこちにあり、両側に1つずつあります。

Hi.So、マウスを解剖する準備が整いました。そして、まずマウスをボードに固定し、ここの解剖ボードに固定します。そして、先に進んで一時停止を固定してください。うん。

安全なピン留め作業であることを確認する必要があります。これにより、末梢リンパ節をよりよく露出させることができます。だから、私は通常、4つの足すべてを固定します。

尻尾は気にしません。尻尾をピンで留めるのが好きな人もいます。そして、解剖している領域に毛皮が入り込み、リンパ節や器具全体に付着するのを防ぐために、マウスに70%のエタノールをスプレーします。

そして、ネズミがエタノールで除草されたので、正中線を切開します。そして、私は毛皮を体から引き離すことによってこれを行います。見える肌を、引き上げて小さなテントを作ることができます。

そして、それはあなたが腹膜を切るのを防ぐことができます、この場合あなたはそれをしたくないです。さて、ここからは正中線の切開から始めましょう。私は小さなカットを作り、腹膜に入らないようにします。

その下に腹膜があるのがわかります。ハサミを切り傷の下に滑り込ませ、ゆっくりと皮膚と腹膜を分離し、頸部リンパ節を採取するので小さな切り込みを入れながら進めます。マウスの顎のラインまで非常に注意深くゆっくりと、主要な血管に当たらないようにカットします。

そして、皮膚フラップの下部にある鼠径リンパ節を採取するため、尾の付け根である尾のあたりまで正中線を切開します。それでは、どうぞ。私たちのための正中線切開があり、それが機能します。

次に、皮膚を腹膜から分離します。私はこれをやさしく、鉗子が腹膜から皮膚を引き離しながら進めます。そして、最初に解剖するリンパ節を露出させています。

これは、ここの下の皮膚フラップにある鼠径リンパ節です。さて、マウスの本体から皮膚フラップを引き抜いたので、それをピンで留めて鼠径リンパ節を露出させます。つまり、鼠径リンパ節の露出が良くなり、きれいに解剖できるようになります。

つまり、ここではピン留め後に鼠径リンパ節が露出しています。通常、ここの脚のすぐ上の皮膚のフラップに見られます。そして、その上を走る血管のY字型の接合部を見ることで見つけることができます。

そして、それはそれです。少しの脂肪が入っていて、その上に血管が走っています。さて、今度は鼠径リンパ節を切除します。

リンパ節の両側に沿って鉗子を滑らせて、脂肪から引き離します。脂肪は一切欲しくありません。当社の2光子イメージングにより、組織のレーザー透過を不明瞭にします。

えっと。リンパ節の脂肪をすべて取り除くことと、リンパ節の皮質を無傷に保つことが重要です。さて、行きましょう。

これが私たちのイエナリンパ節です。私はそれを私たちのメディアに掲載するつもりです、そしてあなたがすべての脂肪を取り除いたかどうかを見分けることができる良い方法は、リンパ節が沈んでいるかどうかです。メディアに入れると、すぐに底まで沈みます。

脂肪があれば浮いてしまいます。さて、今度は補助リンパ節を取り出します。これは、主要な血管に沿ってマウスの脇の下にあります。

そのため、ノードを覆い隠す大量の出血が発生するため、注意が必要な場合があります。でも、私が何をしているのかお見せしますし、今回は出血が出ないことを願っています。そこで、まず皮膚のフラップを外し、実際にこの前腕を取ろうとするノードの隣に入れます。

これにより、指を使ってより器用に皮膚を引き抜くことができますが、脇の下を走るこの筋肉を保持すると、これは穏やかに引っ張ると腋窩節が飛び出します。そして、私は今それを探すつもりです。そして、それはそれです。

それは主要な血管に沿って脇の下にあります。そこで、ここからは腋窩結節を解剖し、皮膚をピンで固定し直したり、指で保持したりと、より快適に感じる方法で行うことができます。しかし、私はこれを慎重に扱うのが好きです。

このリンパ節の周りには脂肪がほとんどないため、イメージングには適していますが、主要な血管の隣にあるため、注意しないと脂肪を失うことがあります。ですから、腋窩リンパ節については、その周りの結合組織をつかみ、ゆっくりと血管から分離しています。さて、これで終わりです。

腋窩結節があります。だから、それはすぐそこにあります。それは素敵な長く平らなリンパ節です。

そして、実際の結節を傷つけないように、結節の側面に残った結合組織を少し握っています。リンパ節の水分を保つためのイメージを作成します。インスティテュートイメージングを行う前に、個々のチャンバー内のCO2に依存しない培地にそれらを配置して、鼠径リンパ節、腋窩リンパ節、および頸部リンパ節を追跡できるようにします。

リンパ節の準備がうまくいったかどうかを見分ける方法は、解剖後にリンパ節が底に沈むかどうかです。つまり、リンパ節には脂肪がほとんどありません。さて、今度は頸部リンパ節、表在性頸部を切除します。

そして、腋窩リンパ節を取り出したときからピンで固定し直すことから始めますが、子宮頸部組織を少し露出させます。そして、頸部リンパ節はマウスの顎の筋肉の近くにあります。実は横に沿って。

それらは、病気になったときに感じるのと同じリンパ節です。彼らはあなたが頭の風邪をひいている場合にあなたの医者が感じるでしょうここにいるものです。そのために、私は通常、組織の下に指を突っ込んで、鉗子を側面に沿ってかすめるときに組織を前方に引っ張るのが好きです。

リンパ節が飛び出しているはずです。あ、あった。それは組織の中にあります。

それがそこにありました。つまり、表在性の頸部リンパ節があります。唾液腺を取らないように注意したいです。

唾液腺にはT細胞は見つかりません。そして、これらの特定のリンパ節には、CFSCで標識されたCDの4つの陽性T細胞があります。そこで、組織内を動き回る細胞のinsituビデオをいくつかお見せします。

さて、次にリンパ節を接着して壊れないプラスチック製のカバースリップにし、insituイメージングステージの底に固定できるようにします。そうすれば、T細胞のイメージング中に組織の動きや組織のドリフトが発生することはありません。だから、ここに私の壊れないプラスチックカバースリップがあります。

私が最初にやろうとしていることは、そのうちの1つをリンパ節に適したサイズに切り詰めることです。だから、ハサミを持って、ここを少し四角く切ります。さて、それでは接着剤を軽くたたきます。

ちょっとした接着剤です。カットしたスライドピースの周りに広げます。そして、キムワイプを取り、接着剤の一部を吸い取ります。

これはノードを覆う接着剤です。イメージングを覆い隠さないように、非常に薄い層が必要です。次に、溶液からリンパ節を取り出します。

では、メディアから取り出した最初のリンパ節から始めます。あなたはこれに優しくしたいです。ノードの皮質を傷つけたくありません。

まずリンパ節の角をスライドまで優しく触れ、次にリンパ節をスライド全体に引っ張ってスライドに固定することで、その角だけをつかんでスライドに接着します。そこで、リンパ節の端に残っていたこの小さな脂肪を使って、それを行いました。ですから、実際には結節の皮質を破壊しているわけではありません。

次にリンパ節を採取し、今度は接着剤を治すために、取り出したのと同じ井戸に浸します。そこで、それを逆さまにして、すべての接着剤を運ぶメディアにそっと浸します。それで硬化したエキソ接着剤を少し取り除きます。

さあ行こう。これで、2光子イメージング用のリンパ節が準備されました。これが、in situの2光子イメージングのためにリンパ節を準備する方法です。

次に、それらを顕微鏡に持って行き、セットアップして、養子として移植したT細胞の素晴らしい画像を取得します。つまり、ここでは、鼠径リンパ節内を動き回るCFSE標識T細胞があります。この動画は約500倍にスピードアップされており、細胞の運動性が高いことが分かります。

これらは、20 x 水浸対物レンズで約 20 倍に拡大されます。これはT細胞の動きの一例にすぎません。私たちは周囲の細胞を染色するために何もしていません。

通常、より高度な2つの写真実験では、樹状細胞を染色し、B細胞を染色し、T細胞を相互作用させてNK細胞を染色することができます。リンパ節の内部に見られると予想されるほぼすべての細胞タイプを標識し、先に進んで画像化することができます。というわけで、当研究所のリンパ節イメージングプロトコルは以上です。