Name: Methoden om Beta Cell Death gemedieerd beoordelen door cytotoxische T lymfocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Leer twee in-vitromethoden om CD8+ T-cel-gemedieerde bètaceldood bij type 1 diabetes te meten: een Chromium-51-release-assay en live-celbeeldvorming met mitochondriale membraanpotentiaalverf.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health DK074656 en AI56374 (CEM), evenals de Juvenile Diabetes Research Foundation.

1. De voorbereiding van de cellen <ol><li> Doelcel cultuur: Cultuur van de muis beta-cellijnen, NIT-1 en NIT-4, werd een eerder beschreven 1,2 in DMEM aangevuld met 10% FBS, 0,02% BSA, niet-essentieel aminozuur, 15MM HEPES, 16,5 mm Glocose en penicilline / streptomycine. Voor 51 Cr etikettering, zaad cellen in een vlakke bodem 96-well plaat cultuur op 5x10 4 cellen / putje in 200 ul kweekmedium. Voor microscopie experimenten, zaad cellen in een acht-goed Lab-Tak II chambered dekglaasje op 5x10 4 per kamer in 500 ul kweekmedium, en laat vooraf laten groeien gedurende 48 uur voor het gebruik in de cytotoxiciteit experimenten. </li><li> Controle T-cellijn cultuur: Gebruik de Jurkat cellijn (ATCC, CD3 + menselijke lymfocyt cellijn) als een negatieve controle. Cultuur Jurkat cellen in RPMI1640 aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1,5 g / L natriumbicarbonaat, 10 mM HEPES en 1,0 mM natrium pyruvaat. </li></ol> 2. Inzameling en activering van effector autoreactieve CD8 + T-cellen NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] en NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] werden gekocht bij The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) en gefokt in onze muis faciliteit. F1 hybride nakomelingen van kruisingen van de NOD-AI4a met NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] de ontwikkeling van diabetes op 3-5 weken oud zijn. Alle muizen werden gehuisvest in specifieke pathogeen-vrij faciliteiten en goedgekeurd door de desbetreffende instelling Animal Care en gebruik Comite. <ol><li> Euthanaseren van 3-4 weken oud NOD-AI4a / b muizen met behulp van CO 2. </li><li> Verzamel milt van muizen. Gedood muizen zijn bereid met ethanol spray en geopend onder de chirurgische kap. Milt is verwijderd en in de ijskoude HBSS buffer onmiddellijk. </li><li> Verzamel milt cellen met behulp van een 7 ml glas homogenisator. Twee tot drie milt elk worden in 5 ml koud HBSS en gehomogeniseerd met een 7 ml glas homogenisator. Homogenaat wordt verzameld en gecentrifugeerd bij 1200 gedurende 5 minuten bij 4 ° C met behulp van een Sorvall RT7 + centrifuge. Celpellets worden verzameld. </li><li> Verwijder de rode bloedcellen met behulp van hypotone oplossing behandeling. Pellets worden behandeld met 5 ml hypotone oplossing / milt op ijs gedurende 5 minuten, vervolgens geneutraliseerd door het toevoegen van een gelijk volume van HBSS. Verzamel cellen door centrifugeren, zoals hierboven, en resuspendeer in 50 ml HBSS. Passeren de geschorste cellen door cellen zeef en te tellen met behulp van een hemocytometer met TrypanBlue vlekken. </li><li> Activeren cellen. Resuspendeer cellen bij 5x10 6 / mL en te activeren met behulp van een 3-daagse cultuur met 0,1 uM AI4 mimotope (aminozuursequentie YFIENYLEL) en 25 U / ml IL-2 in RPMI1640 aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1,5 g / L natriumbicarbonaat, 10 mM HEPES en 1,0 mM natrium pyruvaat. </li></ol> 3. 51 Cr los test om te onderzoeken CML <ol><li> Label doelcellen: Voeg 51 Cr aan cellen op een doel uCi / goed en cultuur voor 3 uur, en 3 keer wassen met kweekmedium. </li><li> Suspend effector-cellen in RPMI 1640-medium, zoals vermeld in stap 2.5, zodat het uiteindelijke volume aan elk putje toegevoegd is 200 pi. </li><li> Na de laatste wasbeurt van gemerkte doelcellen, voeg geactiveerde effector-cellen om het doel celculturen op de gewenste effector naar (E: T) doel ratio's. We meestal gebruik van E: T ratio op 0.4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 en 50:1. </li><li> Voeg verse gewijzigd RPMI 1640 medium (zie stap 2.5) tot 6 wells van target-cellen op te treden als een spontane lysis controle. </li><li> Co-cultuur effector en doelcellen gedurende 16 uur. </li><li> Verzamel supernatant in 6x50 mm Lime glazen buizen </li><li> Lyse cellen door het toevoegen van 100μl 2% SDS en pipetteren een paar keer zachtjes. </li><li> Verzamel cellysaat in een andere set van 6x50 mm Lime glazen buisjes. </li><li> Een keer wassen putten met schone H 2 O en voeg de was naar de cel lysaat buizen. </li><li> Tel de supernatants samen en cellysaten met behulp van een gamma-teller. </li><li> Bereken specifieke lysis als volgt: <img src="files/ftp_upload/2724/2724eq1.jpg" alt="Vergelijking 1"></li></ol> 4. Kleuring van cellen voor live cell imaging Onder de meest gebruikte mitochondriale membraanpotentiaal kleurstoffen, TMRM de minst mitochondriale toxiciteit vertoont. 3 Daarom kiezen we TMRM voor deze live-cell imaging studies. <ol><li> Bereid een 40 mM voorraad TMRM oplossing in DMSO en bewaar bij -20 ° C. Maak een [25 nM] verse werkende oplossing in fenol rood-vrij DMEM met alle supplementen voor NIT-een celcultuur 1. </li><li> Vlek doel NIT-1-cellen met TMRM 25 nM gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Vervang de media met verse media met 5 nM TMRM het evenwicht verdeling van de kleurstof 4 te houden. </li><li> Count geactiveerde effector AI4 T-cellen met behulp van een hematocytometer. </li><li> Vlek geactiveerde effector AI4 T-cellen met een ul / ml Picogreen voor5 minuten bij kamertemperatuur en wassen met fenol rood-vrij kweekmedium 3 keer. </li></ol> 5. Het beoordelen van T-lymfocyt-gemedieerde beta celdood met behulp van live-cell imaging <ol><li> Monteer de chambered dekglaasje met glas NIT-cellen op het podium van een Zeiss LSM 510 confocale microscoop. Verwijder het stickertje met een dremmel en gas de chambered glas steriliseren met Etheline oxide. Het podium is voorzien van een live-cell imaging kamer die de temperatuur geregeld op 37 ° C en 5% CO 2 met vocht. Heeft </li><li> Voeg geactiveerd en gekleurd T-cellen bij de aangewezen kamers op verschillende E: T ratio. </li><li> Toegevoegd hetzelfde aantal gekleurde Jurkat-cellen aan de controle kamers. </li></ol> 6. Het verkrijgen van live-cell beelden De microscoop is uitgerust met een gemotoriseerde fase die liet ons toe om steeds beelden te verwerven op verschillende locaties van dezelfde of verschillende kamers automatisch over het tijdsverloop van het experiment. <ol><li> Met behulp van een 63x olie objectief, foto's maken met een interval van elke 3 minuten voor een totaal van 300 frames per locatie. </li><li> Detecteren TMRM kleuring met behulp van een excitatie golflengte van 543 nm en filterset voor emissie 565 tot 619 nm </li><li> Detecteren Picogreen kleuring met behulp van een excitatie 488 nm en een filter instellen voor emissie 500 tot 630 nm. De video werd gemaakt met behulp van Zeiss LSM-software. </li></ol> 7. Video conversie voor publicatie <ol><li> Met behulp van de LSM Zeiss-software, maakt u een niet-gecomprimeerd filmbestand in een AVI-formaat. </li><li> Om te zetten van de video in de gepubliceerde formaat, importeert u de video in het software pakket Fiji ( <a href="http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji">http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji</a> ), een ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info. nih.gov / ij /</a> ) de distributie, het gebruik van de Bioformats plugin van LOCI ( <a href="http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats">http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats</a> ). </li><li> Pas de helderheid en contrast instellingen om de groene en rode signalen en de framerate was ingesteld op 2 frames / seconde met behulp van de animatie-opties menu balans. </li><li> Snijd de video om 512 x 512 pixels en exporteren als een ongecomprimeerd AVI bestand. </li><li> Open dit AVI-bestand in de software Quicktime 7 (Apple computer, Cupertino, CA) en comprimeren en exporteren in de open video-bestandsformaat H264/MPEG-4 1200 kbs / seconde. </li></ol> 8. Representatieve resultaten: <ol><li> Een vertegenwoordiger resultaat van 51 Cr CML-test. Figuur 1 toont een representatief resultaat van een CML-test, waar procent specifieke lysis (Y-as), neemt toe naarmate de Effector: Target ratio (X-as) toeneemt. Doelcellen zijn primaire eilandjes geïsoleerd van immunodeficiënte NOD Rag1-/ -. Muizen en voorzien van 51 Cr. Splenocyten van NOD.AI4α / β transgene muizen zijn geïsoleerd en geactiveerd, zoals beschreven in stap 2 hierboven. Doelstellingen en effectoren werden samen gekweekt gedurende 16 uur. Percentage specifieke lysis wordt berekend als beschreven in stap 3.11. </li><li> Twee representatieve (positieve en negatieve) resultaten van een T-cel-gemedieerde beta cel mitochondriale membraanpotentiaal dissipatie worden gepresenteerd. Cellen worden gekleurd en de reacties zijn opgenomen zoals beschreven in stap 4, 5 en 6 hierboven, video-bestanden worden gemaakt zoals in stap 7. Video 1: De muis beta cellijn NIT-1 was bevlekt de mitochondriale membraanpotentiaal kleurstof TMRM (rood). Geactiveerd, autoreactieve CD8 + T-cellen AI4 (Stained groen met Picogreen) werden samen gekweekt met deze NIT-1-cellen op een E: T-verhouding van 50:1. NIT-1 mitochondriale membraanpotentiaal geleidelijk aan verdwenen tijdens een 400-minuten duur, maar alleen in de clusters die de interactie met AI4 T-cellen. Video 2: Als een controle-experiment, NIT-1-cellen werden gekleurd met TMRM en co-gekweekt met Picogreen gekleurde Jurkat cellen op een E: T-verhouding van 50:1. Jurkat-cellen zijn een humane T-cel lijn die is MHC verkeerde. NIT-1-cellen aangehouden mitochondriale membraanpotentiaal gedurende de gehele duur van de 400 minuten co-incubatie periode. Jurkat-cellen hadden geen invloed op NIT-1 clusters en dus, niet laten doden. </li></ol><img src="files/ftp_upload/2724/2724fig1.jpg" alt="Figuur 1"> Figuur 1 vertegenwoordiger gevolg van CML gebruiken als doelcellen primaire eilandjes geïsoleerd van immunodeficiëntie NOD.Rag1-/ -. Muizen en splenocyten van NOD.AI4α / β transgene muizen. Doelstellingen en effectoren werden samen gekweekt gedurende 16 uur. Procent specifieke lysis neemt toe naarmate de Effector: Target-ratio toeneemt. Video 1. Mouse beta cellijn NIT-1 was bevlekt de mitochondriale membraanpotentiaal kleurstof TMRM (rood). Geactiveerde autoreactieve CD8 + T-cellen AI4 (Stained groen met Picogreen) werden samen gekweekt met deze NIT-1-cellen bij E: T-verhouding van 50:1. NIT-1 mitochondriale membraanpotentiaal dissipated geleidelijk in een 400-minuten duur, maar alleen in de clusters die de interactie met groene AI4 T-cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/video.mov">Klik hier om video te bekijken</a> . Video 2. NIT-1-cellen werden dezelfde gekleurd zoals beschreven in de Video 1 en co-gekweekt met Picogreen gebrandschilderde humane T-cellijn Jurkat. NIT-1-cellen waren in staat om mitochondriale membraanpotentiaal doordacht de duur van 400 minuten te houden. Jurkat-cellen hadden geen invloed op NIT-1 clusters en dus niet het braken doden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/Video2.mp4">Klik hier om de video te bekijken</a> .

<ol><li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIT-1%2C+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD%2FLt+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li>
<li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li>
<li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li>
<li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+immune-mediated+%28type+1%29+diabetes+mellitus%3A+potential+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li>
<li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+resistance+of+ALR%2FLt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction%3A+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li>
<li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li>
<li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+membrane+potential+%28deltapsi%28m%29%29+in+apoptosis%3B+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li>
<li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li>
<li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li>
</ol>

Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Universiteit van Florida Institutional Animal Care en gebruik Comite.

Cytotoxische T-cel gemedieerde beta celdood is de belangrijkste pathofysiologie van T1D 5. CML testen met behulp van 51 Cr vrijgeven ons toelaten om de graad van effector-target response 6 studiepunten. Echter, de gedetailleerde proces en de paden van T-cel-gemedieerde celdood beta nog steeds niet volledig begrepen. Omdat mitochondriën zijn van cruciaal belang voor de bèta-celfunctie en dood 7, richtten we ons op de mitochondriale veranderingen tijdens de visuele CML. Mitochon...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Cr-51 </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotope </td><td> mimotopes.com </td><td> aminozuursequentie: YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> R &amp; D </td><td> 485-MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumine </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25-060-Cl </td><td></td></tr><tr><td> MEM Niet-essentiële aminozuren </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> Tweelingen </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol rood-vrij DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> CO2 Incubator </td><td> Thermo Fisher </td><td> HeraCell 150i </td><td> Bleef steriel voor celcultuur </td></tr><tr><td> Biologische veiligheid kast </td><td> Thermo Fisher </td><td> Forma 1440 </td><td></td></tr><tr><td> Wegwerp cultuur buizen, 6x50 mm Lime Glas </td><td> Visser </td><td> 14 tot 958-A </td><td></td></tr><tr><td> Gamma Counter </td><td> Perkin Elmer </td><td> Wizard 1470 Automatic Gamma Counter </td><td></td></tr><tr><td> Confocale microscoop </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 Meta Confocale </td><td> Met gemotoriseerde podium en levende cellen kamer </td></tr><tr><td> Pipet (1 ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl) </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubes (Amber) </td><td> Visser </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuge </td><td> Sorvall Legend RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> Hemacytometer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> Upright Microscoop </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ Muizen </td><td> The Jackson Laboratory </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ Muizen </td><td> The Jackson Laboratory </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD-AI4α / β F1 muizen </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Gefokt in UF dier faciliteit </td></tr></tbody></table>

methoden om beta cell death gemedieerd beoordelen door cytotoxische t lymfocyten

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is een T-cel gemedieerde auto-immuunziekte. Tijdens de pathogenese, de patiënten worden steeds meer insulinopenic zoals insuline productie verloren is gegaan, vermoedelijk dit voortvloeit uit de vernietiging van pancreatische beta-cellen door T-cellen. Inzicht in de mechanismen van beta-celdood tijdens de ontwikkeling van T1D zal inzichten verschaffen om een ​​effectieve behandeling voor deze ziekte te genereren. Cel-gemedieerde lymphocytotoxicity (CML) assays van oudsher de gebruikte radionuclide Chroom 51 (51 Cr) om doelcellen label. Deze doelstellingen worden vervolgens blootgesteld aan effector cellen en het vrijkomen van 51 Cr van target cellen wordt gelezen als een indicatie van de lymfocyt-gemedieerde celdood. Remmers van celdood resulteren in een verminderde afgifte van 51 Cr. Als effector cellen, gebruikten we een geactiveerde autoreactieve clonale populatie van CD8 + cytotoxische T lymfocyten (CTL) geïsoleerd van een muis voorraad transgene voor zowel de alfa-en bèta-ketens van de AI4 T-cel receptor (TCR). Geactiveerde T-cellen AI4 werden samen gekweekt met 51 Cr gelabelde doelwit NIT cellen voor 16 uur, vrijlating van 51 Cr werd opgenomen om specifieke lysis te berekenen Mitochondriën deel te nemen aan vele belangrijke fysiologische gebeurtenissen, zoals de productie van energie, de regulatie van signalering transductie, en apoptose. De studie van de beta cel mitochondriale functionele veranderingen tijdens de ontwikkeling van T1D is een nieuw gebied van onderzoek. Met behulp van de mitochondriale membraanpotentiaal kleurstof tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) en confocale microscopische live cell imaging, we gecontroleerd mitochondriale membraanpotentiaal loop van de tijd in de beta-cellijn NIT-1. Voor beeldvorming studies werden effector AI4 T-cellen gelabeld met de fluorescente kleurstof Picogreen nucleaire kleuring. NIT-1-cellen en T cellen werden gekweekt in co-chambered dekglaasje en gemonteerd op de microscoop podium uitgerust met een live-cell kamer, gecontroleerd bij 37 ° C, met 5% CO 2, en bevochtigd. Tijdens deze experimenten foto&#39;s werden genomen van elke cluster om de 3 minuten voor 400 minuten. Meer dan een cursus van 400 minuten, zagen we de afvoer van mitochondriale membraanpotentiaal in de NIT-1 cel clusters waar AI4 T-cellen werden bevestigd. In de gelijktijdige controle-experiment waar NIT-1-cellen werden samen gekweekt met MHC verkeerd afgestemd menselijke lymfocyten Jurkat cellen, mitochondriale membraanpotentiaal intact gebleven. Deze techniek kan worden gebruikt om real-time veranderingen in de mitochondriale membraanpotentiaal in cellen onder aanval van cytotoxische lymfocyten, cytokines, of andere cytotoxische reagentia te observeren.

Cel-gemedieerde lymphocytotoxicity (CML) testen kunnen worden gebruikt voor het autoreactieve reacties en onderzoek naar mechanismen van celdood in vitro test. Echter, met behulp van live-cell confocale microscopische beeldvorming technieken met fluorescente kleurstoffen, het type en de kinetiek van celdood en gebruik gemaakt van de paden worden bestudeerd in meer detail.

Methoden om Beta Cell Death gemedieerd beoordelen door cytotoxische T lymfocyten

Type 1 diabetes (T1D) is een T-celgemedieerde autoïmuunziekte. Tijdens de pathogenese worden patiënten progressief meer insulinopenisch naarmate insuline ...

Diabetes type 1 is een auto-immuunziekte waarbij insuline-secreterende pancreatische bètacellen worden vernietigd door autoreactieve T-cellen. Inzicht in de betrokken mechanismen zal helpen bij het ontwikkelen van een effectieve genezing voor deze ziekte. Hier worden twee methoden gedemonstreerd om de specifieke vernietiging van pancreatische bètacellen door cd8-positieve T-cellen in vitro waar te nemen: een op chromium 51 gebaseerde cel-gemedieerde lymfocytotoxiciteitsanalyse (CML-assay) en een visuele CML-assay.CD8-positieve T-effectorcellen worden eerst geprepareerd uit muizmilten om een CML-assay uit te voeren; Target bèta-cellen uit Knit 1 of Knit 4 worden gelabeld met chroom-51 en gecocultuurd met de effectorcellen. Wanneer de target bèta-cellen worden gedood, komt het chroom-51 vrij. De supernatanten en cellysaten worden vervolgens verzameld en de radioactiviteitsniveaus, die de mate van celdood aangeven, worden gemeten met een gammacounter. Om een visuele CML-assay uit te voeren, worden Target bèta-cellen uit Knit 1 en Knit 4 gelabeld met de mitochondriale potentiaal kleurstof TM RM en worden de effectorcellen gelabeld met PicoGreen.De cellen worden gecombineerd en er wordt

methods-to-assess-beta-cell-death-mediated-by-cytotoxic-t-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het chromium afgifte assay, een gemeenschappelijke test voor het detecteren cytotoxische T-celactiviteit, heeft verschillende beperkingen. Gebruikmakende van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen en humane borsttumor lijn, SKBR3, in dit artikel is een impedantie-gebaseerde aanpak onderzocht kan detecteren celdoding.

Het bepalen van optimale cytotoxische activiteit van de mens Her2neu Specifieke CD8 T cellen door vergelijking van de Cr51 afgifte test aan de xCELLigence System

The video showcases a flow cytometry-based assay for assaying immunodominance in cytotoxic T lymphocytes or CTL responses. Injected fluorescent target cells exhibit varying fluorescence corresponding to immunogenic epitopes. Post-spleen collection and sorting reveal a reduction in high-intensity fluorescent cells, confirming immunodominance in CTL responses.

An Assay to Evaluate Immunodominance in Cytotoxic T Lymphocyte Responses

Dit protocol beschrijft een gevoelige, cel-gebaseerde cytotoxiciteit assay. Door het tellen van de afname in frequentie van levende doelwit CD4+ T-cellen in aanwezigheid van een toenemend aantal effector CD8+ T-cellen, staat deze assay toe de directe beoordeling van de cytolytische activiteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen.

Celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit te meten

Het vermogen om T-cel responsen in detail volgen in vivo is belangrijk voor de ontwikkeling van ons begrip van de immuunrespons. Hier beschrijven we het gebruik van fluorescerende doel arrays (FTA's) in een in vivo T-cel test die&gt; 250 parameters beoordeelt gelijktijdig door flowcytometrie.

Het gebruik van TL-Target Arrays voor het beoordelen van de T-cel responsen<em&gt; In vivo</em

Het doel van dit protocol is dat voor de opsporing van in vivo antigeen-specifieke doden van een cel in een lymfkliertest model.

In Vivo Assay voor detectie van antigeen-specifieke T-cel cytolytische functie met behulp van een vaccinatie-Model

We beschrijven hier een protocol om te onderzoeken van de cytotoxiciteit van pre-geactiveerde CD8+ T cellen tegen kankercellen door het detecteren van apoptotic kanker cellen via real-time microscopie. Dit protocol kan mechanismen achter myeloïde cel-geïnduceerde T cel onderdrukking onderzoeken en evalueren van de verbindingen die zijn gericht op het aanvullen van T cellen via blokkade van onderdrukkende myeloïde immuuncellen.

Real-time detectie van In Vitro Tumor cel Apoptosis geïnduceerd door CD8+ T cellen te bestuderen immuun onderdrukkende functies van Tumor-infiltreren myeloïde cellen

We beschrijven hier een flow Cytometry-based in vivo doden assay die het mogelijk maakt onderzoek van immunodominance in chemo T lymfocyten (CTL) Reacties op een model tumor antigeen. Wij bieden voorbeelden van hoe deze elegante assay kan worden gebruikt voor mechanistische studies en voor de effectiviteit van geneesmiddelen testen.

Maatwerk in vivo chemo tests om Immunodominance in tumor-specifieke CD8+ T Cell responsen te bestuderen

Dit artikel beschrijft een protocol voor het genereren van antigeen-specifieke CD8 T-cellen, en de uitbreiding ervan in vitro, met als doel het opleveren van een hoog aantal functionele T-cellen voor gebruik in vitro en in vivo.

Zeer efficiënte generatie van antigeen-specifieke cytotoxische T-cellen voor de functionele test in een auto-immune diabetes model

Dit protocol beschrijft de chirurgische generatie van orthotopic alvleesklier tumoren en de snelle vertering van vers geïsoleerde lymfatische alvleesklier tumoren. Na de spijsvertering kunnen levensvatbare immuuncelpopulaties worden gebruikt voor verdere downstream-analyse, inclusief ex-vivo stimulatie van T-cellen voor intracellulaire cytokine detectie door Flowcytometrie.

Generatie van Orthotopic alvleesklier tumoren en ex vivo karakterisering van tumor-Infiltrerende T cel cytotoxiciteit

Deze studie maakt gebruik van multi-kleuring fluorescentie-gebaseerde markers van celdood en apoptose in combinatie met confocale microscopie om cytokine-geïnduceerde apoptose en β-celspecifieke dood in pancreaseilandjes te beoordelen. Het onthult ruimtelijke en temporele veranderingen in celdood en apoptose als reactie op extracellulaire stimuli.

Geïsoleerde behandeling van pancreaseilandjes en meting van apoptose

Leer twee in-vitromethoden om CD8+ T-cel-gemedieerde bètaceldood bij type 1 diabetes te meten: een Chromium-51-release-assay en live-celbeeldvorming met mitochondriale membraanpotentiaalverf.

Methoden om Beta Cell Death gemedieerd beoordelen door cytotoxische T lymfocyten

Meer video's verkennen