Name: Vibrodissociation de las neuronas del cerebro de roedores Rodajas para el Estudio de la transmisión sináptica y la imagen terminales presinápticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprende la técnica de vibrodissociación de neuronas de roedores para estudiar la transmisión sináptica y visualizar terminales presinápticos. Este método permite un control farmacológico superior y mejora las condiciones de registro electrofisiológico.

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Queremos agradecer a los Dres. Ping Zhu y Koyama Susumu por su ayuda durante la configuración inicial de la técnica, y la Dra. Verónica Alvarez de asistencia en el formato del manuscrito. Este estudio fue financiado por la División de Investigación Intramural clínica y biomédica de NIAAA.

<ol><li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+potentiates+gabaergic+synaptic+transmission+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Ethanol potentiates gabaergic synaptic transmission in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurophysiol. 96, 433-441 (2006).</li>
<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+endocannabinoid+signaling+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retrograde endocannabinoid signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurosci. 25, 6199-6207 (2005).</li>
<li>Akaike, N., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques%3A+Applications+of+the+nerve-bouton+preparation+in+neuropharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Techniques: Applications of the nerve-bouton preparation in neuropharmacology.</a> Trends Pharmacol Sci. 24, 44-47 (2003).</li>
<li>Akaike, N., Murakami, N., Katsurabayashi, S., Jin, Y. H., Imazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+stimulation+of+single+gabaergic+presynaptic+boutons+on+the+rat+hippocampal+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Focal stimulation of single gabaergic presynaptic boutons on the rat hippocampal neuron.</a> Neurosci Res. 42, 187-195 (2002).</li>
<li>Ye, J. H., Wang, F., Krnjevic, K., Wang, W., Xiong, Z. G., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+glycine+receptors+on+gabaergic+terminals+facilitate+discharge+of+dopaminergic+neurons+in+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic glycine receptors on gabaergic terminals facilitate discharge of dopaminergic neurons in ventral tegmental area.</a> J Neurosci. 24, 8961-8974 (2004).</li>
<li>Koyama, S., Matsumoto, N., Kubo, C., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+5-ht3+receptor-mediated+modulation+of+synaptic+gaba+release+in+the+mechanically+dissociated+rat+amygdala+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic 5-ht3 receptor-mediated modulation of synaptic gaba release in the mechanically dissociated rat amygdala neurons.</a> J Physiol. 529, 373-383 (2000).</li>
<li>Deng, C., Li, K. Y., Zhou, C., Ye, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+enhances+glutamate+transmission+by+retrograde+dopamine+signaling+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+the+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Ethanol enhances glutamate transmission by retrograde dopamine signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from the ventral tegmental area.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1233-1244 (2009).</li>
<li>Murakami, N., Ishibashi, H., Katsurabayashi, S., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+subtypes+on+single+gabaergic+presynaptic+terminal+projecting+to+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium channel subtypes on single gabaergic presynaptic terminal projecting to rat hippocampal neurons.</a> Brain Res. 951, 121-129 (2002).</li>
<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+synaptic+activity+produces+long-lasting+enhancement+of+endocannabinoid+modulation+and+alters+long-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Persistent synaptic activity produces long-lasting enhancement of endocannabinoid modulation and alters long-term synaptic plasticity.</a> J Neurophysiol. 97, 4386-4389 (2007).</li>
<li>Inada, H., Maejima, T., Nakahata, Y., Yamaguchi, J., Nabekura, J., Ishibashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+contribute+to+metabotropic+glutamate+receptor-mediated+inhibition+of+gaba+release+onto+hippocampal+ca3+pyramidal+neurons+in+an+isolated+neuron%2Fbouton+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids contribute to metabotropic glutamate receptor-mediated inhibition of gaba release onto hippocampal ca3 pyramidal neurons in an isolated neuron/bouton preparation.</a> Neuroscience. 165, 1377-1389 (2010).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+recycling+studied+in+transgenic+mice+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptophluorin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6131-6136 (2005).</li>
</ol>

Vibrodissociation requiere que las rebanadas contienen las neuronas sanas y que los espacios intersticiales son lo suficientemente flexibles para permitir a las neuronas para salir de la corte sin daño tóxico. Por lo tanto, la técnica funciona de manera óptima en las primeras edades posnatales (P1-21) cuando rebanadas sano se puede hacer con menos material gliales / interstiatial que se encuentra en rodajas de cerebro de un adulto. En nuestra experiencia, sin embargo, la optimización de la preparación de división para la supervivencia neuronal en el corte en sí mismo puede ser contraproducente para la técnica de vibrodissociation. Mientras que de manera rutinaria para preparar cortes en la grabación in situ utilizando LCRa frío modificada en la que la sacarosa se ​​ha sustituido por la mayor parte del Na + extracelular y Ca 2 +, rebanadas preparado para vibrodissociation se puede preparar (por ejemplo, corte) en nuestro LCRa grabación normal. En la preparación de cortes para la grabación de las neuronas individuales en los mismos cortes que también ponga las rebanadas en ACSF normal a 35 ° C justo después de la sección y se dejan durante 30-60 min a esta temperatura antes de devolverlos a temperatura ambiente. Sin embargo, las rebanadas preparado para vibrodissociation se trasladó inmediatamente a temperatura ambiente justo después de cortar. Estos procedimientos proporcionan un mayor rendimiento de las neuronas sanas después de vibrodissociation, quizás debido a la falta de tejido firme intersticial que permite que las neuronas sean más fácilmente sacudido de la misma rebanada. No hemos examinado exhaustivamente las condiciones de corte de preparación, ya que habitualmente obtienen las neuronas suficientes para nuestra grabación y experimentos de imagen en un día determinado. Es posible que las modificaciones adicionales, tales como cambios en el grosor de corte o procedimientos preincubaton, se podría hacer para aumentar el rendimiento de las neuronas sanas. Tratamientos de la proteasa muy leves han sido probados en un esfuerzo por aumentar el rendimiento celular y obtener la técnica para trabajar en los animales más viejos. Sin embargo, invariablemente, incluso el tratamiento de la proteasa leve parece alterar la función sináptica. Así, mientras que la combinación de la proteasa y la disociación mecánica todavía se pueden encontrar para trabajar, no ha demostrado ser fiable en las neuronas del cerebro anterior a la fecha. También debe tenerse en cuenta el rendimiento relativamente bajo de las neuronas sanas después de vibrodissociation significa que la técnica es especialmente útil para el estudio de abundante subtipos neuronales, principalmente las neuronas de proyección. La disponibilidad de las buenas prácticas agrarias-que expresa los ratones en los que pequeñas subpoblaciones neuronales pueden ser fácilmente identificados aumenta la posibilidad de estudiar estas neuronas más raro. Sin embargo, a menos que el rendimiento neuronal se puede mejorar sustancialmente la acumulación de datos sobre estas neuronas es probable que sea relativamente lenta. Varias medidas han demostrado ser crucial para el éxito de carga de las neuronas sensibles al calcio con colorantes. La exposición a la PM-esterificados tinte se realiza a 37 ° C, y que no han tenido éxito al tratar de colorante de carga a temperaturas más bajas. La concentración de los colorantes deben ser optimizados teniendo en cuenta tanto el tiempo de carga y la temperatura, ya que parece que la mayor concentración de colorante de carga reduce la concentración de calcio en el boutons presináptica. Hemos observado que la carga con una mayor concentración disminuye la frecuencia y la amplitud de sIPSCs. Cuando la carga sensible al calcio en los tintes terminales presinápticas de las neuronas vibrodissociated, se debe tener cuidado, porque la capacidad amortiguadora de la boutons presináptica pequeña puede ser diferente que en el soma y el tamaño de boutons no son consistentes. Las neuronas que contienen los platos se lavan con solución amortiguadora HEPES-externa después de colorante de carga, y el tiempo de recuperación después del lavado es crucial. Además, para lograr un buen sello de células enteras de grabación, las células se deben lavar a fondo para deshacerse de los no internalizan las moléculas del tinte de la membrana celular externa. Además de usar las neuronas vibrodissociated de imágenes de células de electrofisiología y en directo, las técnicas de inmunohistoquímica también se puede aplicar a estas células 11,12. Las células se pueden fijar fácilmente y se tiñeron con una variedad de anticuerpos, y otros marcadores de la célula. El uso de estas células proporciona una preparación de limpieza para la visualización de la expresión de proteínas en GABAérgicas terminales presinápticos. Utilizando ratones que expresan proteínas fluorescentes bajo el control de promotores específicos de las neuronas GABAérgicas permite al investigador para identificar los terminales sinápticos individuales en la preparación de la vibrodissociated (Figura 1). Marcadores fluorescentes de imágenes de este tipo puede permitir mediciones morfológicas en las terminales de uso basada en el láser y nuevas técnicas de microscopía como STED (Emisión Estimulación Microscopía agotamiento). Visualización con tintes que el informe de ciclismo vesículas sinápticas también es posible con esta preparación. Akaike y compañeros de trabajo han etiquetado terminales GABAérgicas con el tinte estirilo, FM1-43 para visualizar las terminales de las células vivas 4. También debería ser posible llevar a cabo una sola célula de la transcriptasa inversa PCR al perfil de la expresión del ARN en vibrodissociatedlas neuronas. Esta técnica se aplica habitualmente a enzimáticamente disociarse las neuronas y las neuronas en cultivos celulares.

<table border="1"><tbody><tr><td> Artículo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo # </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Vibrando Slicer tejido </td><td> Leica Microsystems Inc. </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Placa de cultivo celular (35 mm) </td><td> BD Falcon </td><td> 353001 </td><td></td></tr><tr><td> Platos con fondo de cristal </td><td> Willco plato </td><td> GWSB O-5040-3522 GWSB </td><td> 0,16-0,19 mm de espesor de vidrio para la imagen </td></tr><tr><td> Manipulador piezoeléctricos </td><td> EXFO-Burleigh </td><td> LSS-3000 </td><td> También puede utilizar relés, etc </td></tr><tr><td> SD9 Plaza de estimulador de impulsos </td><td> Tecnologías de la hierba </td><td> SD9K </td><td> Para activar manipulador piezoeléctricos </td></tr><tr><td> Disección Estereoscopio </td><td> Salvaje Heerbrugg </td><td> TYP 374590 </td><td> También puede utilizar cualquier estereoscopio </td></tr><tr><td> Flaming / Brown micropipeta extractor </td><td> Sutter Instrumento </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Pared Delgada capilares de vidrio </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> TW-150F-4 </td><td> De la llama de vidrio selladas micropipeta y micropipeta parche </td></tr><tr><td> Seis canales de perfusión sistemas de válvulas de control </td><td> Warner Instrumentos </td><td> VC-6 o VC-6M </td><td></td></tr><tr><td> Perfusión rápida Paso </td><td> Warner Instrumentos </td><td> SF-77B </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio invertido con 20-63x objetivos </td><td> Nikon </td><td> TS200 Diaphot </td><td></td></tr><tr><td> EMCCD Cámara </td><td> Andor Technology </td><td> ixon EM + DU-888 </td><td></td></tr><tr><td> Excite iluminación de fluorescencia fuente de luz </td><td> EXFO Fotónica Solutions Inc. </td><td> X-Cite 120PC </td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4, AM indicador de calcio </td><td> Las sondas moleculares </td><td> F14201 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibrodissociation de las neuronas del cerebro de roedores rodajas para el estudio de la transmisión sináptica y la imagen terminales presinápticos

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Disociación mecánica de las neuronas del sistema nervioso central tiene la ventaja de que boutons presináptica de permanecer unidos a la neurona aislada de interés. Esto permite un examen de la transmisión sináptica en condiciones en los ambientes intracelular extracelular y postsinápticos se puede controlar bien. Una técnica basada en la vibración sin el uso de proteasas, conocidos como vibrodissociation, es la técnica más popular para aislamiento mecánico. Una micropipeta, con la punta pulida al fuego a la forma de una pelota pequeña, se coloca en una rebanada del cerebro a partir de una P1-P21 roedores. La micropipeta se vibra paralelo a la superficie de corte y baja a través del grosor de corte que resulta en la liberación de neuronas aisladas. Las neuronas aisladas están listos para su estudio a pocos minutos de vibrodissociation. Esta técnica tiene ventajas sobre el uso de cultivos primarios de neuronas, las secciones de cerebro y las neuronas aisladas enzimáticamente, incluyendo: una rápida producción de neuronas viables, relativamente maduros adecuados para estudios electrofisiológicos y de imagen, mayor control del medio ambiente extracelular libre de la influencia de las células vecinas; idoneidad para bien controlados experimentos farmacológicos utilizando la aplicación del fármaco y la rápida superfusión total de células, y la mejora del espacio-clamp en células enteras grabaciones en relación con las neuronas en el segmento o preparaciones de cultivo de células. Esta preparación se puede utilizar para examinar la fisiología sináptica, la farmacología, la modulación y plasticidad. Imágenes en tiempo real tanto de los elementos pre-y post-sinápticas en las células vivas y boutons También es posible usar las neuronas vibrodissociated. Caracterización de los componentes moleculares de los elementos pre-y post-sináptica también se puede lograr con los métodos inmunológicos y de imágenes basadas en.

Este informe demuestra una técnica para aislamiento mecánico de las neuronas individuales viable mantener unido boutons presináptica. Vibrodissociated neuronas tienen la ventaja de una rápida producción, el control farmacológico excelente y mejora del espacio-clamp sin la influencia de las células vecinas. Este método puede ser utilizado para obtener imágenes de los elementos sináptica y la grabación de patch-clamp.

Vibrodissociation de las neuronas del cerebro de roedores Rodajas para el Estudio de la transmisión sináptica y la imagen terminales presinápticos

La disociación mecánica de neuronas del sistema nervioso central tiene la ventaja de que los botones presinápticos permanecen unidos a la neurona aislada de...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en aislar neuronas que conservan botones sinápticos desprendidos pero aún adheridos, lo que permite un control farmacológico y una mejor sujeción espacial, al tiempo que se elimina la influencia de las células vecinas. Esto se logra preparando cortes cerebrales agudos de ratas o ratones desde el día posnatal P1 hasta P21 que contienen el área cerebral de interés, para así aislar neuronas individuales como segundo paso. Los cortes agudos se colocan en un recipiente y se vibra una micropipeta de vidrio sellada con llama dentro del área de interés mientras se mueve la punta a través del corte, lo que libera neuronas individuales.Se permite tiempo a las neuronas para que se adhieran al fondo del recipiente. A continuación, el recipiente que contiene neuronas disociadas de fibroblastos se traslada a un microscopio con el fin de examinar la fisiología sináptica, farmacología, modulación, plasticidad, así como la obtención de imágenes en tiempo real y la caracterización de elementos pre y postsinápticos en la célula viva; los resultados obtenidos muestran las características fisiológicas y farmacológicas de las respuestas sinápticas y los cambios asociados en la función del terminal presináptico mediante registros en configuración de sello apretado (en célula íntegra) y microscopía de fluorescencia. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el registro en cortes cerebrales, neuronas en cultivo y neuronas disociadas enzimáticamente, es que la sinapsis compacta adherida permite el control y la visualización de los elementos presinápticos, mientras que la estructura postsináptica relativamente compacta posibilita un mejor clampaje de voltaje y un control excepcional del entorno extracelular.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el rendimiento para obtener neuronas sanas puede variar considerablemente según varias condiciones, como la edad del animal, los parámetros de vibración y la zona de interés en el corte. Además, las personas experimentan que las grabaciones celulares duran menos tiempo que en los portaobjetos convencionales. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de disociación mediante vibración son difíciles de aprender debido a la dificultad para describir con precisión la distancia de movimiento y la disociación a través del corte. Para prepararse para la elaboración de los cortes cerebrales, prepare un líquido cefalorraquídeo artificial burbujeado con carbógeno (ACSF) durante 15 minutos.A continuación, añada cloruro de calcio de dos milimolar y cloruro de magnesio de un milimolar. Después de anestesiar y decapitar un animal de edad posnatal P uno a 21, extraiga el cerebro y córtelo en la orientación deseada para incluir la región de interés. Fije el cerebro diseccionado a una platina y sumérjalo en una cámara llena de A CSF.Luego monte la cámara sobre un cortador de cerebro y seccione el cerebro en cortes de 250 a 400 micrómetros de grosor con una cuchilla vibrante. Coloque los cortes en un ACSF y burbujéelo con carbógeno en una cámara de preincubación durante al menos una hora. Para preparar una micropipeta de vidrio sellada con llama, primero tire de una micropipeta estándar para registro de parche con un diámetro de punta de dos micrómetros en un extractor de micropipetas tipo Flaming Brown o equivalente.Coloque la punta de la micropipeta en la llama de un mechero Bunsen durante aproximadamente dos segundos para formar una bola fusionada de 200 a 300 micrómetros de diámetro. A continuación, coloque la micropipeta sellada con llama en un soporte del micromanipulador que pueda vibrar rápidamente de lado a lado con una distancia de desplazamiento de 100 a 200 micrómetros, utilizando un relé bimorfo piezoeléctrico o un dispositivo igualmente eficaz. Prepare una solución salina tamponada. Ajuste la solución con hidróxido de sodio a pH 7,4 y la osmolaridad con sacarosa a aproximadamente 300 miliosmoles. Luego, llene un recipiente de cultivo de 35 milímetros de diámetro con abundante solución salina tamponada. Coloque una sección en el recipiente de cultivo y visualícela con un estereoscopio de disección a 250 aumentos utilizando un alambre doblado.Sujete el corte en el fondo del recipiente para disociar las células. Coloque la punta de la micropipeta sellada con llama sobre la superficie del corte. Active el micromanipulador para que la punta vibre lateralmente entre 10 y 30 hercios con una distancia de desplazamiento de aproximadamente 100 micrómetros.Baje la punta de la micropipeta en el corte con el micromanipulador de modo que atraviese toda la profundidad en 30 segundos. Repita este paso según sea necesario para maximizar el número de neuronas aisladas. A continuación, retire la punta del corte.Agarre la sección con pinzas y agítela suavemente en la solución. Luego, retire completamente la sección de la solución. Deje que las células sedimenten en el fondo del recipiente durante al menos 10 minutos.Coloque la placa que contiene las neuronas sobre la platina de un microscopio invertido y visualícelas con un objetivo de 1x a 63x. Busque neuronas que tengan membranas lisas sin burbujas y núcleos detectables, pero no excesivamente grandes. Si se utilizan ópticas de contraste de fase, busque neuronas con contraste de fase brillante y un matiz amarillento, pero no demasiado azulado.Extraiga una micropipeta de parche estándar utilizando un extractor de tipo flaming brown o un equipo equivalente, con una resistencia en la punta de la pipeta entre dos y cuatro megaohmios. Llene la micropipeta de parche con una solución intracelular a base de cloruro de cesio para la medición de respuestas sinápticas o con una solución intracelular a base de cloruro de potasio para la medición de propiedades intrínsecas de la membrana y potenciales de acción. Realice el registro de parche en configuración de célula completa sobre la neurona utilizando técnicas electrofisiológicas estándar.Primero, registre corrientes postsinápticas espontáneas utilizando un protocolo de adquisición de datos continuo. A continuación, aplique 200 nan animales o toxina tetradódica y/o una solución extracelular con bajo contenido de calcio para registrar corrientes postsinápticas miniatura y así modificar el contenido molecular extracelular. Los fármacos de interés se cargan individualmente en uno de los compartimentos de un tubo de vidrio cuadrado fusionado con punta, el cual se posiciona cerca de la neurona de interés.Un barril individual se expone al neutrón mediante un micromanipulador accionado por un motor paso a paso que se mueve lateralmente para permitir el intercambio de solución en 10 a 100 milisegundos. Observe los bns descargados con alta magnificación y con un objetivo de alta apertura numérica en un microscopio basado en cámara o de múltiples fotones. Aquí se muestra la imagen de un neutrón y de los bns capturados con una cámara de dispositivo de carga acoplada con multiplicación electrónica.La potencia de la fuente de luz para la excitación se atenuó al 1,2 % con un filtro de densidad neutra de 1,0 y un filtro de iris ajustado al 12 % de la salida durante las grabaciones en condición de bloqueo de voltaje. Con una solución intracelular basada en cloruro de cesio, se observan corrientes sinápticas espontáneas para visualizar la fusión vesicular. En los botones presinápticos, hemos utilizado ratones que expresan el constructo sináptico de florina bajo el control del promotor TH1.El florina sináptica es un constructo molecular en el que la florina eclíptica, un mutante de GFP con mayor sensibilidad al pH, se une a la proteína de membrana asociada a vesículas tras la fusión vesicular. Este motivo queda expuesto al entorno extracelular más neutro, con un consiguiente aumento de la fluorescencia en puntos que corresponden a vesículas y terminales presinápticos. La disociación de fibras de neuronas hipocampales de estos ratones permite la visualización de puntos fluorescentes del tamaño y ubicación esperados para terminales GABAérgicos durante el intento de este procedimiento.Es importante recordar que, para tener neuronas sanas, debe asegurarse de tener cortes sanos. Por lo tanto, la preparación de cortes cerebrales agudos es un paso fundamental en este procedimiento. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como inmunohistoquímica o RT-PCR individual de células, con el fin de responder preguntas adicionales, como qué proteínas y especies de ARNm se expresan en los botones sinápticos o en las neuronas postsinápticas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener neuronas aisladas sanas y utilizarlas para electrofisiología, así como para imágenes en tiempo real.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Se demuestra el uso de la pistola de genes para introducir tintes fluorescentes, como DII, en las neuronas en secciones de cerebro de los roedores y primates no humanos de diferentes edades. En este caso particular, utilizamos ratones adultos (3-6 meses de edad) y adultos de los monos cynomologus (9-15 años). Esta técnica, descrita originalmente por el laboratorio del Dr. Lichtman...

Etiquetado DiOLISTIC de las neuronas de los roedores y no humanos rodajas de cerebro de los primates

El video describe el registro electrofisiológico de las sinapsis retinogeniculadas y corticogeniculadas en cortes de cerebro de ratón. Los cortes que contienen el núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) se colocan en una cámara de registro. Se coloca una pipeta estimulante en el tracto óptico para estimular las células ganglionares de la retina (RGC) e investigar las sinapsis retinogeniculadas o en el núcleo reticularis thalami para estimular las neuronas corticales e investigar las sinapsis...

Un estudio electrofisiológico de las sinapsis retinogeniculadas y corticogeniculadas en cortes de cerebro de ratón

Este video demuestra el procedimiento para estudiar la eficiencia sináptica en la corteza entorrinal lateral (LEC) mediante la estimulación optogenética de los axones de la corteza prefrontal medial (mPFC) y el registro de las respuestas de las neuronas piramidales en la LEC. Este método combina registros de patch-clamp con activación sináptica por estimulación lumínica para estudiar la plasticidad sináptica.

Estimulación optogenética y registro electrofisiológico de eventos sinápticos en cortes de cerebro de rata

Fuente: McLeod, F., et al. Evaluación de la densidad de sinapsis en cortes de cerebro de roedores hipocampales. J. Vis. Exp. (2017). Este video muestra un método para visualizar marcadores sinápticos en cortes de cerebro del hipocampo utilizando el análisis de inmunofluorescencia confocal. Los cortes se inmunotiñen con anticuerpos primarios dirigidos a marcadores presinápticos y postsinápticos, seguidos de anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos. A continuación, los marcadores...

Análisis microscópico de sinapsis en cortes de hipocampo de ratón mediante inmunofluorescencia

El registro de las corrientes de Ca2+ en la membrana frontal de liberación presináptica es clave para una comprensión precisa de la entrada de Ca2+ y la liberación de neurotransmisores. Presentamos una disociación aguda de la médula espinal de la lamprea que produce axones reticuloespinales aislados funcionales, lo que permite el registro directo desde la membrana de la cara de liberación de las terminales presinápticas individuales.

Agudo Disociación de lamprea reticuloespinal axones para permitir la grabación del estreno de la cara de la membrana de individuales Terminales presinápticos funcionales

registros de patch-clamp y el llenado simultáneo de biocitona intracelular de neuronas sinápticamente acopladas en cortes agudos de cerebro permiten un análisis correlacionado de sus propiedades estructurales y funcionales. El objetivo de este protocolo es describir los pasos técnicos esenciales del registro electrofisiológico a partir de microcircuitos neuronales y su posterior análisis morfológico.

Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones

Un protocolo para identificar con precisión y analizar sinapsis en rebanadas hippocampal mediante inmunofluorescencia se describe en este artículo.

Evaluación de la densidad de sinapsis en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor

Se presenta un método que combina grabaciones de celulares-abrazadera del remiendo y la proyección de la imagen de dos fotones para registrar a transitorios de Ca2 + en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro agudo.

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Describimos procedimientos para el procesamiento de tejido cerebral de rata recién nacida para obtener micrografías electrónicas de alta resolución para el análisis morfolométrico de la distribución de vesículas sinápticas en los terminales nerviosos. Los micrográficos obtenidos con estos métodos también se pueden utilizar para estudiar la morfología de un número de otros componentes celulares y sus relaciones estructurales dimensionales.

Preparación del tejido cerebral de rata recién nacida para el análisis Morfolométrico ultraestructural de la distribución de vesículas sinápticas en los terminales nerviosos

Aquí presentamos un protocolo que describe la transducción viral de regiones cerebrales discretas con construcciones optogenéticas para permitir la caracterización electrofisiológica específica de la sinapsis en cortes cerebrales agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogación optogenética de la transmisión sináptica de largo alcance y la plasticidad de la corteza prefrontal medial a la corteza entorrinal lateral

Este protocolo presenta un método robusto y detallado para obtener sinaptosomas altamente puros, vesículas sinápticas y otras fracciones sinápticas del cerebro del ratón. Este método permite la evaluación de procesos sinápticos, incluyendo el análisis bioquímico de la localización y función de proteínas con resolución compartimental.

Fraccionamiento subcelular para el aislamiento de componentes sinápticos del cerebro murino

Aprende la técnica de vibrodissociación de neuronas de roedores para estudiar la transmisión sináptica y visualizar terminales presinápticos. Este método permite un control farmacológico superior y mejora las condiciones de registro electrofisiológico.

Vibrodissociation de las neuronas del cerebro de roedores Rodajas para el Estudio de la transmisión sináptica y la imagen terminales presinápticos (Video) | JoVE Journal

Vibrodissociation de las neuronas del cerebro de roedores Rodajas para el Estudio de la transmisión sináptica y la imagen terminales presinápticos

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