Name: PCR multiplex e Reverse Blot Assay Linea Hybridization (MPCR / RLB) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Scopri il metodo mPCR/RLB per la rilevazione simultanea di patogeni mediante PCR multiplex e hybridization reverse line blotting. Questa tecnica economica e ad alto throughput consente l'identificazione rapida di sequenze nucleiche in campioni clinici.

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Matteo O&#39;Sullivan e Fei Zhou sono destinatari di Australian National Health and Medical Research Council Borse di studio post-laurea la ricerca medica.

Attenta considerazione deve essere data primer e di progettazione della sonda. Tutte le sequenze a disposizione degli obiettivi di interesse da database GenBank, come dovrebbe essere utilizzato per identificare le aree conservate che sono obiettivi adatti. Dove un gran numero di obiettivi vengono amplificate in un test di MPCR singole, ciascuna sequenza amplificata devono essere di lunghezza simile, e non deve superare i 300 paia di basi di evitare la concorrenza. Un'applicazione alternativa del metodo è quello di amplificare un obiettivo più a lungo utilizzando primer contro le regioni conservate e di utilizzare più sonde per identificare variazione di sequenza nel amplicone. In questo caso, il prodotto amplificato PCR può essere più lungo. Temperature di ricottura fondo dovrebbero essere tutti simili, con condizioni di PCR adeguati di conseguenza. Primer che formano una forte struttura secondaria o dimero primer deve essere evitato. La Sigma Aldrich DNA calcolatrice ( <a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp</a> ) può essere usata per predire in modo affidabile queste caratteristiche. Sonde di DNA deve essere progettato per avere ricottura temperature prossime a 60 ° C. Per massimizzare la specificità, due sonde per ogni target di interesse possono essere inclusi nel saggio, una ibridazione per il filamento di DNA in avanti adiacente al sito fondo inverso vincolante, e l'altro al filone invertire adiacente al sito primer forward vincolanti. In questo caso, entrambi i primers avanti e indietro deve essere biotina-modificato. Se solo una sonda per bersaglio amplificato viene utilizzato, allora solo un innesco necessario biotina modificato. Nella progettazione di primer e sonde per la MPCR / RLB saggio è fortemente consigliato di utilizzare metodi in silico per prevedere i prodotti di PCR e ibridazione sonda correlati con i risultati in vitro. Idealmente questo viene fatto usando ceppi per i quali la sequenza del genoma completo è disponibile. Software come FastPCR (disponibile presso http://primerdigital.com/fastpcr.html) può essere utilizzato per questo scopo. Segnale della sonda debole o assente è possibile prevedere dove in analisi in silico indica discordanze coppia di basi con conseguente temperature basse sonda ricottura. Tecniche di estrazione del DNA varia a seconda dei campioni testati, e le condizioni di PCR sarà dipendente da disegno primer. I lettori si riferiscono a pubblicazioni su test individuali per ulteriori informazioni riguardanti l'estrazione del DNA e reagenti PCR e le condizioni di 1-19. Ogni test viene eseguito con i controlli appropriati alle fornire almeno un segnale positivo e uno negativo per ciascuna sonda sonda sulla membrana, così come un DNA senza controllo. Inoltre è utile per includere una sonda nella parte superiore della membrana che dovrebbe essere positivo per tutti i campioni (per esempio: una specie o genere sonda specifica nel caso di un microrganismo). Questo serve come una sonda di controllo positivo, ma permette anche un facile orientamento dei risultati. 1. Preparazione di membrane <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni: <ul><li> 100ml NaHCO3 0,5 M (pH 8,4) </li><li> 100 ml 0.5M NaHCO 3 </li><li> 20 ml EDAC 16% </li><li> 250 ml di NaOH 0,1 M </li><li> 250 ml 2xSSPE </li><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - posto a bagnomaria a 60 ° C </li><li> 250 ml di 20 mM EDTA. </li></ul></li><li> Preriscaldare il forno a 60 ° C. </li><li> Pulire il Miniblotter Immunetics con il 70% di etanolo. </li><li> Diluire le sonde oligonucleotidiche in 0,5 M NaHCO 3 a una concentrazione finale di 2 pmol / mL e un volume di 200 l. </li><li> Tagliare una membrana di nylon BiodyneC a cm 15x15. Usando una matita e righello, regola off di 0,5 cm di spazio in alto di membrana e scrivere dettagli qui. </li><li> Membrana di tenuta in sacchetto di plastica con 20 ml di soluzione EDAC appena fatto il 16% e il rock a temperatura ambiente per 10 minuti. </li><li> Lavare membrana in acqua deionizzata per 30 secondi. </li><li> Membrana posto in miniblotter con canali che attraversano la membrana (parallela alla linea di matita). Mettere cuscino di supporto al suo posto e carta assorbente vicino. Aspirare il liquido dai canali. </li><li> Compila corsie 1 e 45 con 150 microlitri 0,5 M NaHCO 3. Utilizzare 150 ml di ogni soluzione sonda a riempire corsie 2-44 in sequenza, facendo attenzione ad evitare bolle d'aria. Se una bolla d'aria è presente nel canale, mantenendo la pipetta in posizione, rapidamente aspirare la soluzione per consentire la bolla d'aria a salire in cima alla pipetta, poi riprovare. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. </li><li> Aspirare soluzioni sonda, rimuovere membrane e lavare in 250 ml 0,1 M NaOH a temperatura ambiente per 9 minuti. </li><li> Lavare membrana in 250 ml 2xSSPE per 30 secondi. </li><li> Lavare membrana in 250 ml preriscaldata 2xSSPE/0.1% SDS in forno a 60 ° C per 5 minuti. </li><li> Se non viene utilizzato per l'ibridazione immediatamente, lavare membrana in 240 ml di 20 mM EDTA a temperatura ambiente per 20 minuti (riservando 10ml rimanente), poi sigillare membrana in sacchetto di plastica con altri 10 ml di 20 mM EDTA e Store in frigo a 4 ° C. </li><li> Lavare con miniblotter Pyroneg detergente e pennello. Risciacquare e lasciare asciugare. </li></ol> 2. Ibridazione e rilevazione <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni: <ul><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - conservare in bagno d'acqua a 60 ° C. </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - conservare in bagno d'acqua a 60 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - conservare in forno a 42 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE - conservare a temperatura ambiente </li><li> 500 ml 1% SDS - conservare in bagno d'acqua a 60 ° C inizialmente (per la fase 3) </li><li> 250 ml di 20 mM EDTA - conservare a temperatura ambiente (per la fase 3). </li></ul></li><li> Accendere un forno a 60 ° C e un forno a 42 ° C. Portare l'acqua a bollire in un recipiente di grandi dimensioni su piastra. </li><li> Immunetics pulito Miniblotter con il 70% di etanolo. </li><li> Aliquota 10 ml di 2xSSPE/0.1% SDS in un piccolo contenitore. Aggiungere 20 ml di ciascun prodotto PCR di 150 microlitri SDS 2xSSPE/0.1% in provette numerate. </li><li> Fate bollire i prodotti di PCR per 10 minuti a 100 ° C utilizzando titolari polistirolo. Mettere in ghiaccio immediatamente per almeno 5 minuti. </li><li> Lavare membrana rimanenti 240 ml 2xSSPE/0.1% SDS a 60 ° C forno per 5 minuti. </li><li> Membrana posto in miniblotter con cuscino supporto. Orientare in modo da eseguire canali in senso verticale (perpendicolare alla linea di matita). </li><li> Aspirazione liquido in eccesso dai canali miniblotter. </li><li> Aggiungi restanti 150 microlitri SDS 2xSSPE/0.1% ai canali e cognome. Aggiungi bollito prodotti di PCR per i restanti canali (2-44) in sequenza, facendo attenzione ad evitare bolle d'aria. </li><li> Luogo miniblotter appartamento in forno a 60 ° C per 1 ora per consentire ibridazione di prendere posto. </li><li> Aspirare il liquido da ogni canale quindi rimuovere membrana da miniblotter. </li><li> Lavare due volte in 250 ml preriscaldata 2xSSPE/0.5% SDS a 60 ° C forno per 10 minuti. </li><li> Inumidire maglia di nylon che separano con 2xSSPE/0.5% SDS a 42 ° C e utilizzarlo per rimboccarsi membrana. </li><li> Luogo arrotolato membrana nel tubo a rulli, e dispiegare per assicurare membrana confina con la superficie interna. Aggiungere 3 ml streptavidina-perossidasi coniugato (Roche Applied Science) a 15 ml 2xSSPE/0.5% SDS a 42 ° C e aggiungere al rullo avvolgitore. Tappo a vite su e incubare in forno a rulli a 42 ° C per 60 minuti. Assicurare la direzione di tiro è tale che membrana non stringe. Controllare periodicamente la tenuta. </li><li> Lavare miniblotter in Pyroneg acqua e detergente, risciacquare e lasciare asciugare. </li><li> Rimuovere membrana da rullo avvolgitore. Lavare due volte nella restante 2xSSPE/0.5% SDS a 42 ° C per 10 minuti. </li><li> Lavare due volte in 2xSSPE a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Girare forno fino a 80 ° C e luogo 500ml 1% SDS in forno pre-caldo. </li><li> Portare 15 ml soluzione di rilevamento Amersham ECL (7,5 ml di soluzione A e 7,5 ml di soluzione B). Gettare 2xSSPE e aggiungere la soluzione di rilevazione. Roccia delicatamente a mano per 2 minuti, garantendo una copertura completa di membrana con la soluzione. Scartare la soluzione chemiluminescente. </li><li> Tagliare due fogli di plastica trasparente per adattarsi cartuccia esposizione. Membrana tra i due fogli e cartucce in luogo di esposizione. </li><li> Procedere alla camera oscura. Sotto la luce rossa, aggiungere pellicola ECL rilevamento di cartuccia ed esporre per 5 minuti. Dog-ear nell'angolo inferiore destro del film dopo la rimozione per consentire il corretto orientamento durante la visualizzazione. </li><li> Sviluppare la pellicola con lo sviluppatore automatizzati o bagni chimici come istruzioni del produttore per il. </li><li> Ripetere l'esposizione con tempi di esposizione più o meno lungo, se necessario. </li></ol> 3. Rigenerazione della membrana <ol><li> Lavare membrana in 250 ml 1% SDS a 80 ° C per 30 minuti due volte. </li><li> Lavare membrana in 240 ml di 20 mM EDTA a temperatura ambiente per 15 minuti. </li><li> Membrana di tenuta in sacchetto di plastica con 10 ml di 20 mM EDTA e conservare in frigorifero a 4 ° C per il futuro riutilizzo. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: I risultati sono migliori viste mettendo il film su una griglia stampata, oppure la scansione l'immagine e l'importazione in un software come BioNumerics (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgio). Ogni risultato sonda dovrebbe essere interpretato con riferimento alle sonde di controllo positivo e negativo. I risultati sono migliori classificati come negativo, debolmente o positivo. Risultati positivi sono dove il segnale è forte come o più forte la sonda di controllo positivo. Risultati negativi sono dove il segnale è assente o uguale al controllo negativo (nel caso di segnale di fondo). I risultati sono deboli dove il segnale è più debole la sonda di controllo positivo, ma più forte rispetto al controllo negativo. Risultati debole può essere il risultato di mutazioni puntiformi che porta al legame della sonda deboli, o per non specifici segnali di formazione innesco dimero. Utilizzando due sonde per target di interesse in grado di migliorare la specificità, in cui un unico risultato debole può tranquillamente essere interpretato come non specifico segnale. Se qualche dubbio rimane, un unico complesso reazione di PCR può essere eseguita con gel a base di rilevazione e sequenziamento di qualsiasi amplificatorelified prodotto per determinare se il risultato è veramente positivo. Un risultato rappresentativo è mostrato in figura 2. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Il MPCR / RLB principi (P1) Punto 1.9. Amine sonde modificate sono legati covalentemente a una membrana di nylon. (P2) Passo 2.10. Biotina modificati prodotti di PCR sono ibridate alle sonde. (P3) Passo 2.14. Streptavidina, marcato con perossidasi, è incubato con la membrana e si lega alla biotina. (P4) Piazza di 2,19-2,21. Perossidasi catalizza una reazione nei reagenti di rilevazione ECL, producendo luce a cui la luce sensibilità di una pellicola esposta. La membrana viene poi lavata per il riutilizzo. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Rappresentante MPCR / RLB risultato. I campioni da 1 a 6 rappresentano i controlli positivo - tra di essi vi è almeno un segnale della sonda positivo per ciascuna delle 43 sonde. Ogni sequenza bersaglio (da A a U) viene rilevato con due sonde differenti per massimizzare la specificità. Sonde A1 e A2 rappresentano specie sonde specifiche che dovrebbero essere positivo per ogni campione e assistere orientare il film. Sonda A1 si ripete in fondo la membrana. I campioni 7 e 8 sono controlli negativi. Si noti che Q1 sonde, Q2, T1 e T2 hanno segnale nei controlli negativo, indicando probabile legame aspecifico dei primer o dimero prodotto primer. Ri-progettazione di queste sonde o primer sarebbe necessario. Sonde C1, D1 e F1 mostrare striature attraverso la membrana probabilmente a causa di alcuni non-specifico di assorbimento della streptavidina-perossidasi coniugato e substrato chemiluminescente, tuttavia questo è facilmente distinguibile dal vero i segnali positivi della sonda. Sonde D1 e D2 hanno segnale relativamente debole rispetto alle altre sonde, questo può essere dovuto al maggiore ampliconi che porta all'amplificazione meno efficienti. Sonda J2 è negativo è diversi campioni (1, 3, 4, 6, 39) dove la sonda J1 è positivo. Questo molto probabilmente rappresenta una mutazione nel sito J2 vincolante per questi esempi.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il MPCR / RLB metodo permette la rilevazione simultanea di un gran numero di ampliconi della PCR. A causa della elevata sensibilità della sonda chemiluminescenza a base di rilevazione, una singola reazione di PCR multiplex con un gran numero di coppie di primer può essere utilizzato per amplificare il modello del DNA. Se nessun segnale della sonda si ottengono con uno o più campioni, eseguendo l&#39;elettroforesi su gel con tutti i prodotti rimanenti PCR può aiutare a distinguere se il problema è con l&#39;amplificazione PCR o ibridazione della sonda. Dove tutti i segnali della sonda sulla membrana sono deboli o assenti, ma elettroforesi su gel indica successo PCR, le possibilità sono problemi con l&#39;etichettatura della membrana, la rigenerazione non corretta della membrana dopo l&#39;uso precedente, le temperature non corretto durante l&#39;incubazione ibridazione o streptavidina, o difettoso streptavidina- perossidasi coniugato o reagenti di rilevamento. Se i campioni di controllo indicano che le sonde individuo può essere la produzione di falsi segnali negativi, PCR singola con gel a base di rilevazione e sequenziamento successive possono essere eseguite per verificare l&#39;amplificazione del prodotto PCR e per cercare variazione di sequenza nel sito di legame della sonda. Segnale della sonda debole o assente può essere dovuto alla dimensione amplicone di grandi dimensioni: se possibile, tutti ampliconi devono essere di lunghezza simile e meno di 300 bp. Le strutture secondarie del DNA di ampliconi può anche produrre vincolante poveri sonda, e potrebbe essere necessario ri-progettazione di primer. Primer o concentrazioni sonda può anche essere variata per ottimizzare la potenza del segnale. Falsi segnali positivi grazie alla sonda di legame del primer nonamplified o primer-dimero prodotto può essere indagato eseguendo singole PCR con gel a base di rilevazione e la sequenza successiva. In questo caso, riprogettazione delle sonde possono risultare necessarie. Mutazioni puntiformi nei siti di legame della sonda può portare a segnali deboli o assenti. Permettere due sonde per ogni prodotto amplificato rende questo facile da individuare. Questa caratteristica può essere sfruttata con primer e attenta progettazione della sonda per rilevare piccole variazioni di sequenza del DNA bersaglio. In sintesi, mentre ci sono molti metodi di prodotto reazioni PCR multiplex dopo la rilevazione disponibile, MPCR / RLB ha il vantaggio di essere high-throughput e poco costoso, con bassi costi di setup. La flessibilità del metodo ne consenta l&#39;uso in una vasta gamma di applicazioni.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> 5 &#39;ammina C6 modificato sonde oligonucleotidiche </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-8875 </td><td> 0,5 M soluzione di fatto fino a pH 8,4 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td> 0,1 M soluzione </td></tr><tr><td> 20xSSPE tampone </td><td> Amresco </td><td> 0810-4L </td><td></td></tr><tr><td> Di sodio dodecil solfato (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L-4390 </td><td> Make up soluzione madre al 10%, non in autoclave, devono essere conservati per un massimo di 1 settimana prima di utilizzare </td></tr><tr><td> Etilendiamminotetraacetico acido (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td> Portare la soluzione 0,5 M a pH 8.0 e autoclave </td></tr><tr><td> N-(3-dimetilamminopropil)-N &#39;-ethylcarbodiimide cloridrato (EDAC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7750 </td><td> Portare a 20 ml di soluzione al 16% al momento dell&#39;uso con 3,2 g EDAC e 18 ml di acqua Millipore </td></tr><tr><td> BiodyneC 0,45 micron a membrana in nylon 20x20 centimetri </td><td> PALL scienze della vita </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Deionizzata, acqua depurata </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pyroneg detersivo liquido </td><td> Johnson Diversey </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidina-perossidasi coniugato </td><td> Roche </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL rilevamento reagenti </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL rilevamento reagenti </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Pellicole per lucidi OHP </td><td> Corporate Express </td><td> EXP 504 OHP </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL hyperfilm ad alte prestazioni film di chemiluminescenza 18x24 cm </td><td> GE Healthcare </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> Ghiaccio </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Materiali di consumo utilizzati nel MPCR / RLB test. <table border="1"><tbody><tr><th> Attrezzatura </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Forni Shake&#39;n&#39;Stack Hybaid (2) bottiglia di rotolamento e nylon mesh separazione </td><td> Thermo Scientific </td><td> HBSNSRS220 </td><td> Metodo può essere eseguito con un singolo forno fino a quando non vi è impianto per il mantenimento di soluzioni a 42 ° C e 60 ° C prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> La Danzatrice del ventre oscillante </td><td> Stovall scienze della vita </td><td> Euro BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> Mn100-45 </td><td></td></tr><tr><td> Bagnomaria </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aspirazione </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Placca di cottura </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> L&#39;esposizione della cartuccia </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z36 ,009-0 </td><td></td></tr><tr><td> X-ray film sviluppatore </td><td></td><td></td><td> È anche possibile utilizzare sviluppo, fissaggio e acqua in vaschette in una stanza buia, invece di automazionesviluppatore. Lumino-imager può anche essere usato al posto della pellicola Xray </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Apparecchiature necessarie per il MPCR / RLB test.

pcr multiplex e reverse blot assay linea hybridization (mpcr / rlb)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Multiplex PCR / Reverse Blot test Linea ibridazione permette di rilevare fino a 43 bersagli molecolari in 43 campioni con una reazione multiplex PCR seguita da ibridazione sonda su una membrana di nylon, che è riutilizzabile. Le sonde sono 5 &#39;amina modificato per consentire la fissazione alla membrana. Primer sono 5 &#39;biotina modificato che permette di individuare i prodotti di PCR ibridato con streptavidina-perossidasi e di un substrato chemiluminescente tramite pellicola fotosensibile. Con l&#39;installazione e bassi costi di consumo, questa tecnica è poco costoso (circa US $ 2 per esempio), ad alto rendimento (membrane multiple possono essere trattati contemporaneamente) e ha un breve periodo di tempo di risposta (circa 10 ore). La tecnica può essere utilizzata in diversi modi. Sonde multiple possono essere progettati per rilevare variazione di sequenza all&#39;interno di un singolo prodotto amplificato, o più prodotti possono essere amplificati simultaneamente, con uno (o più) sonde per il rilevamento successive. Una combinazione di entrambi gli approcci possono essere utilizzati anche all&#39;interno di un singolo test. La possibilità di includere sonde multiple per una sequenza bersaglio unico rende il test altamente specifici. Applicazioni pubblicate su MPCR / RLB comprendono il rilevamento di 1,2 geni di resistenza agli antibiotici, la digitazione di Staphylococcus aureus resistente alla meticillina 3-5 e Salmonella sp 6, sierotipizzazione molecolare di 7,8 Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae 9 e enterovirus 10,11, identificazione di Mycobacterium sp 12, il rilevamento di 13-15 genitale e le vie respiratorie 16 e altri 17 agenti patogeni e la rilevazione e l&#39;identificazione delle Mollicutes 18. Tuttavia, la versatilità della tecnica significa che le applicazioni sono praticamente illimitate e non limitato ad analisi molecolare di microrganismi. I cinque passi in MPCR / RLB sono: a) Primer e il design della sonda, b) estrazione del DNA e PCR amplificazione c) Preparazione della membrana, d), ibridazione e rilevazione, ed e) La rigenerazione della membrana.

Un poco costoso, metodo throughput elevato per il rilevamento simultaneo di fino a 43 bersagli molecolari è descritto. Applicazioni di MPCR / RLB comprendono digitando microbica e la rilevazione di agenti patogeni multipli da campioni clinici.

PCR multiplex e Reverse Blot Assay Linea Hybridization (MPCR / RLB)

Il saggio di PCR multiplex/ibridazione Reverse Line Blot consente la rilevazione di fino a 43 target molecolari in 43 campioni utilizzando un'unica reazione di PCR multiplex...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la presenza o l'assenza di un pannello di sequenze specifiche di acidi nucleici precedentemente amplificate in una reazione di PCR multiplex. Questo viene ottenuto fissando innanzitutto sonde di DNA marcate con ammina a una membrana di nylon riutilizzabile. I prodotti della PCR marcati con biotina vengono quindi ibridati con le sonde legate alla membrana e strep TTR in perossidasi.Il coniugato viene aggiunto ai prodotti PCR legati. Successivamente, i prodotti PCR legati vengono rilevati aggiungendo reagenti di rilevamento chemiluminescenti ed esponendo la membrana a una pellicola radiografica ad alta sensibilità. Infine, la membrana viene lavata per rimuovere i prodotti PCR ibridati, consentendo il suo riutilizzo in saggi futuri.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'ibridazione dei prodotti PCR con le sonde legate alla membrana, visibili sulla pellicola radiografica. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la PCR multiplex, l'elettroforesi su gel, la PCR in tempo reale o il microarray, sono l'elevata capacità di analisi, la relativa rapidità, l'assenza di necessità di attrezzature specializzate e, soprattutto, il basso costo. Prima di iniziare, preparare le seguenti soluzioni seguendo la parte scritta di questo protocollo.Per preparare la membrana, preriscaldare il forno a 60 gradi Celsius. Pulire il mini blotter con etanolo al 70%, diluire le sonde di oligonucleotidi in bicarbonato di sodio 0,5 molar a una concentrazione finale di due picomoli per microlitro e un volume di 200 microlitri. Tagliare la membrana di nylon a 15 per 15 centimetri, utilizzando una matita e un righello per delimitare uno spazio di 0,5 centimetri lungo il bordo superiore della membrana, e scrivere in tale zona i dettagli dell'esperimento.Sigillare la membrana in un sacchetto di plastica con 20 millilitri di soluzione di EDAC al 16% appena preparata e agitare a temperatura ambiente per 10 minuti. Lavare la membrana con acqua deionizzata per 30 secondi. Successivamente, posizionare la membrana in un mini blotter con canali disposti trasversalmente rispetto alla membrana.Quindi posizionare il cuscino di supporto e chiudere il blotter. Aspirare accuratamente qualsiasi liquido dai canali. Riempire le corsie 1 e 45 con 150 microlitri di bicarbonato di sodio 0,5 molare.Utilizzare 150 microlitri di ciascuna soluzione sonda per riempire in sequenza le corsie da 2 a 44, avendo cura di evitare bolle d'aria. Se dovesse apparire una bolla d'aria nel canale, mantenere la pipetta in posizione ed aspirare rapidamente la soluzione in modo che la bolla d'aria risalga in cima alla punta della pipetta, quindi riprovare. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.Aspirare le soluzioni della sonda. Rimuovere la membrana e lavarla in 250 millilitri di idrossido di sodio 0,1 molare a temperatura ambiente per nove minuti. Lavare la membrana in 250 millilitri di SSPE 2X per 30 secondi.Quindi lavarlo in 250 millilitri di SSPE 2× pre-riscaldato con 0,1% SDS in forno a 60 gradi Celsius per cinque minuti, se non si utilizza immediatamente per ibridazione. Lavare la membrana in 240 millilitri di EDTA 20 millimolare a temperatura ambiente per 20 minuti. Successivamente, sigillare la membrana in un sacchetto di plastica con i rimanenti 10 millilitri di EDTA 20 millimolare e conservare a quattro gradi Celsius.Infine, lavare il mini blosser con detergente per collo pirite e una spazzola, risciacquare e lasciare asciugare in multiplex. L'amplificazione mediante PCR delle sequenze di interesse non è descritta in questa dimostrazione, ma deve essere eseguita prima dell'ibridazione. Prima di iniziare la procedura di ibridazione, preparare le seguenti soluzioni secondo la parte scritta di questo protocollo.Accendere un forno e impostarlo a 60 gradi Celsius e un altro forno a 42 gradi Celsius. Portare l'acqua a ebollizione in un becher grande su un piastra riscaldante. Pulire il mini blotter con etanolo al 70%.Successivamente, prelevare un'aliquote di 10 millilitri di SSPE 2 volte con 0,1% SDS in un contenitore piccolo. Poi aggiungere 20 microlitri di ciascun prodotto PCR a 150 microlitri di SSPE 2 volte con 0,1% SDS in provette numerate. Portare a ebollizione i prodotti PCR per 10 minuti a 100 gradi Celsius utilizzando supporti in polistirolo, quindi porre immediatamente in ghiaccio per almeno cinque minuti.Lavare la membrana nei rimanenti 240 millilitri di SSPE 2x con 0,1% di SDS nel forno a 60 gradi Celsius per cinque minuti. Posizionare la membrana nel mini blotter con il cuscinetto di supporto. Orientarla in modo che i canali siano disposti verticalmente.Aspirare il liquido in eccesso dai canali del mini blotter. Aggiungere i restanti 150 microlitri di SSPE 2 volte con 0,1% SDS ai canali primo e ultimo. Aggiungere i prodotti PCR bolliti nei canali da 2 a 44 in sequenza, avendo cura di evitare bolle d'aria.Posizionare il mini blotter in piano nel forno a 60 gradi Celsius per un'ora per consentire l'ibridazione. Spruzzare il liquido da ogni canale. Quindi rimuovere la membrana dal mini blotter.Lavare due volte in 250 millilitri di SSPE 2 volte, 0.5% SDS nel forno a 60 gradi Celsius per 10 minuti. Inumidire il supporto in nylon con SSPE 2 volte, 0.5% SDS a 42 gradi Celsius ed utilizzarlo per arrotolare la membrana. Posizionare la membrana arrotolata in un tubo rotante ed eseguire la rotazione per assicurare che la membrana aderisca alla superficie interna.Aggiungere tre microlitri di strept AD in coniugato con perossidasi a 15 millilitri di SSPE due volte, 0,5% SDS a 42 gradi Celsius e aggiungere al tubo. Chiudere saldamente il coperchio e incubare nel forno rotante a 42 gradi Celsius per 60 minuti. Assicurarsi che il senso di rotazione sia tale per cui la membrana non si tenda.Controllare periodicamente la presenza di perdite. Lavare il mini blotter con detergente per vetreria e risciacquare con acqua, quindi lasciarlo asciugare. Rimuovere la membrana dal tubo del rullo e lavarla due volte nel resto della soluzione SSPE 0,5% SDS a 42 gradi Celsius per 10 minuti.Quindi lavare due volte in SSPE 2x a temperatura ambiente per cinque minuti. Impostare entrambi i forni a 80 gradi Celsius e posizionare 500 millilitri di SDS 1% in un forno per preriscaldare. Preparare la soluzione ECL e incubare la membrana nella soluzione di rilevamento ECL per due minuti.Quindi esporre la membrana al film e sviluppare. Ripetere l'esposizione con tempi più lunghi o più brevi se necessario per rigenerare la membrana. Lavare con 250 millilitri di SDS 1% a 80 gradi Celsius per 30 minuti, due volte.Quindi lavare con 240 millilitri di EDTA 20 millimolare a temperatura ambiente per 15 minuti. Sigillare la membrana in un sacchetto di plastica con 10 millilitri di EDTA 20 millimolare e conservare in frigorifero a quattro gradi Celsius per un successivo riutilizzo. Questa figura mostra i risultati di un saggio di ibridazione multiplex PCR con blot inverso su linea. I campioni da uno a sei rappresentano controlli positivi tra loro.È presente almeno un segnale positivo per ciascuno dei 43 sonde. Ogni sequenza bersaglio da A a U viene rilevata mediante due sonde diverse per massimizzare la specificità delle sonde. Una sonda uno e una sonda due rappresentano sonde specifiche per specie, che si prevede risultino positive per ogni campione e che aiutano a orientare la sonda su pellicola.Un uno è ripetuto nella parte inferiore della membrana. I campioni sette e otto sono controlli negativi. Si noti che le sonde Q1, Q2, T uno e T due mostrano segnale nei controlli negativi, indicando un probabile legame non specifico degli inneschi o la formazione di dimeri di innesco.Sarebbe necessaria una riprogettazione dei prodotti di queste sonde o primer, poiché le sonde C1, D1 e F1 mostrano strisce lungo la membrana, probabilmente a causa di un certo assorbimento non specifico della streptavidina perossidasi coniugata o del substrato chemiluminescente. Tuttavia, questo fenomeno è facilmente distinguibile dai segnali veri e propri delle sonde positive. Le sonde D1 e D2 presentano segnali relativamente deboli rispetto alle altre sonde.Questo potrebbe essere dovuto al fatto che ampliconi più grandi portano a un'amplicificazione meno efficiente. Infine, la sonda J due risulta negativa in diversi campioni in cui la sonda J uno è positiva. Ciò molto probabilmente rappresenta una mutazione nel sito di legame di J due per questi campioni.Una volta padroneggiata questa tecnica, dall'estrazione del DNA fino all'ibridazione PCR Pro, all'interpretazione dei risultati e alla rigenerazione della membrana, tutto può essere completato in meno di 10 ore.

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