開発マウス網膜の in vivoエレクトロポレーションで

この手順の全体的な目標は、遺伝物質を網膜の細胞に安定して導入するために、新生児マウスでin vivoエレクトロポレーション実験を行うことです。これは、最初に麻酔をかけ、新生児マウスを氷の上で約5〜10分間ポップすることによって達成されます。手順の2番目のステップは、融合したまぶたの接合部を特定し、この接合部に沿って切断して目を開くことです。

次に、マイクロインジェクションシリンジの挿入を容易にするために、眼に切開を行います。次に、マイクロインジェクションシリンジを切開部に挿入し、DNA溶液を網膜下腔に注入します。最後に、ピンセット電極をポップの頭に取り付け、一連の電気パルスを送達します。

この技術がレトロウイルス形質導入などの既存の方法よりも優れている点は、in vivoエレクトロポレーションでは、遺伝子導入のツールとして生物学的薬剤の生成と取り扱いを必要としないことです。その結果、この技術は必要な労力と試薬が少なくて済み、動物用処置が承認された任意のワークステーションで実施できます。一般に、この技術に不慣れな人は、マイクロインジェクション注射器を網膜下腔に配置する感触をつかむのに時間と繰り返しが必要なため、苦労するでしょう。

その手順を実演するのは、私の研究室のポスドク研究員であるジミー・デミロです。エレクトロポレーションに必要なDNA濃度が比較的高いため、目的のプラスミドDNAは、まずマキシプレップを使用して抽出された無能細胞を増幅し、次に精製してマイクロリットルあたり約5マイクログラムに濃縮します。高速グリーンFCF染料をインジェクショントレーサーとして添加します。

プラスミドDNAを調製したら、新生児マウスの仔を氷上で約5分間麻酔し、フットパッドの圧迫によって意識が失われるまでモニタリングします。注射する眼の領域を70%isopプロファイルアルコールと交換し、解剖顕微鏡を使用してまぶたが集まるFUS接合部上皮を特定します。鋭利な30ゲージの針を使用して、過度の下向きの圧力を加えたり、まぶたの範囲を超えて切断したりせずに、融合した接合部上皮に沿って切断することにより、慎重に目を開きます。

まぶたを開けて目が露出したら、針の先端を使用して角膜との接合部近くの強膜に小さな切開を行い、深く浸透してレンズに穴を開けないように注意してください。鈍端の注射針を切開部に挿入します。反対側の強膜壁の抵抗が感じられるまで、0.3マイクロリットルの粘性DNA溶液を網膜下腔にゆっくりと注入します。

強膜壁を強く押しすぎないように注意しながら、動物を回転させて、網膜内にDNA溶液が均一に広がることを確認します。まず、ピンセット電極をPBSに浸して、電気伝導率を最大化します。次に、注入された子犬の頭を電極の間に配置し、注入されたアイが正極電極に隣接し、注入されなかったアイが負極電極に隣接します。

パルス発生器を使用して、各パルスが80ボルト、持続時間が50ミリ秒で、パルス間の間隔が950ミリ秒の5つの方形パルスを印加します。最後に、子犬が氷の麻酔から回復するまで、温めるランプの下で子犬を温めます。回復したら、エレクトロポレーションした子犬を生後3日目に母親に戻します。

EGFPエレクトロポレーション細胞の大部分は網膜神経可塑性層に位置し、網膜の分化神経グリア細胞のいずれにも明確な形態学的特徴を示しません。出生後14日目までに、エレクトロポレーションされた細胞が網膜の外側の核層と内側の核層、およびさまざまな標識細胞に見つけることができます。分化したニューロンの特徴的な形態学的特徴を示すようになりました。

この手順を試行するときは、すべての手順をスムーズかつ均等に実行することが重要です。マイクロインジェクション中に網膜を損傷するのは非常に簡単で、組織の損傷を避けるために必要な手先の器用さを開発するために必要な実践が必要です。この手順に従います。

免疫組織化学またはin situハイブリダイゼーションなどの他の方法は、目的の遺伝子の発現が電気網膜においてアップまたはダウンレギュレーションされているかどうかを決定するために実施されてもよい。