ReAsH / 플래시 라벨링 및 전지 Tetracysteine​​ 센서 단백질의 이미지 분석

본 실험 절차의 전반적인 목적은 tetra cysteine 및 형광 표지가 된 단백질을 발현하는 세포를 flash 또는 ash 염료로 표지하고, 그 결과를 정량적으로 분석하는 것입니다. 이를 위해 우선 형광 단백질과 tetra cysteine 태그가 포함된 표적 단백질을 운반하는 플라스미드를 대상 세포주에 형질전환합니다. 그 다음, 발현된 단백질을 R 또는 flash로 표지하고, BAL로 세척하여 비특이적으로 결합된 염료를 제거함으로써 현미경 이미징을 준비합니다.

그 다음 공초점 현미경을 사용하여 ash 또는 flash 및 형광 단백질 채널의 세포 형광 이미지를 수집합니다. 마지막으로, Image J를 사용하여 이미지를 분석함으로써 표적 단백질에 대한 ash 또는 flash의 결합 정도를 정량화합니다. 최종적으로, ash 형광과 형광 단백질 형광의 상관관계를 통해 세포 내 표적 단백질에 대한 ash 또는 flash의 결합 정도를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

단순히 GFP를 표적 단백질과 함께 발현시키는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 단백질의 국소화뿐만 아니라 구조적 변화와 같은 단백질의 두 번째 특성을 추적할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 TAC의 결합 또는 해리 능력을 변화시키는 층판 형성 이벤트, 구조적 변화 및 LI 결합 이벤트와 같이 단백질 하부 구조 및 기능 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 저희는 세포 내에서 헌팅틴(Huntington) 단백질의 미세한 하위 현미경적 다량체(polygamous)가 어떻게 형성되는지 평가하고자 했을 때 처음으로 이 방법 아이디어를 얻었습니다.

데이터 분석 단계는 기술적으로 복잡하여 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 실험 절차를 시연하겠습니다. 1단계부터 3단계까지는 저희 연구실의 연구 보조원인 Yasmin Ranson이 데이터 분석을 시연할 것입니다. 4단계는 저희 연구실의 대학원생인 Sevki GaN이 진행하겠습니다. 관심 있는 세포주에 대해 표준 세포 배양법을 사용하고, 형질전환 준비가 된 살아있는 세포 이미징 슬라이드를 사용하십시오.

관심 있는 TC 태그 유전자를 포함하는 플라스미드를 트랜스펙션할 부착 세포 배양액을 준비하십시오. 선택한 트랜스펙션 방법에 따라 진행합니다. TC 태그에 대한 특이적 결합 정도를 평가하고, 공초점 현미경 사진을 수집할 때 채널 간의 형광 누설(bleed-through)을 평가하기 위해 양성 및 음성 대조군을 설정하는 것이 중요합니다. 따라서 두 가지 색상을 사용하는 경우, 형광 단백질 단독 또는 가능한 경우 형광 물질에 결합된 T ctech 단백질 등 단일 색상에 대한 샘플이 준비되었는지 확인하십시오.

단, 형광 단백질은 제외합니다. transfection 1~2일 후, 미리 데워둔 300 µL의 Hank's balanced salt solution 또는 HBSS로 세포를 부드럽게 헹굽니다. 10 µM의 1,2-ethanedithiol(EDT)과 1 µM의 ASH가 포함된 신선한 prewarm HBSS를 준비하십시오. 세포에서 HBSS를 제거한 후, 300 µL의 ASH 배지로 조심스럽게 교체하고 조직 배양 인큐베이터에서 37 °C로 정확히 30분 동안 배양합니다.

저희의 경험에 따르면, 배양 시간이 길어질수록 배경 형광이 상당히 증가합니다. 세포에서 라벨링 용액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 250 µM의 two three dimer, cap propanol 또는 BAL이 포함된 37 °C로 예열된 HBSS 300 µL로 교체하여 15분 동안 처리합니다. 세척 용액을 조심스럽게 흡입하여 제거한 후, 예열된 HBSS 300 µL로 교체합니다.

이 세척 단계 이후에 세포를 파라포름알데히드로 고정할 수 있으나, 이 경우 비특이적 배경 형광이 증가하는 것을 확인하였습니다. 따라서 당사는 보통 상온에서 살아있는 세포를 이미징합니다. 또한, 표지 전 세포를 고정하면 dye 결합이 방해됩니다.

공초점 현미경으로 세포 이미징을 시작하려면, 개별 형광 표지를 이미징하기 위한 파라미터를 설정하고 채널 간의 블리드스루(bleed through)가 거의 없는지 확인하십시오. 다음으로, 시료의 최대 형광 강도가 검출기를 포화시키지 않도록 광전자 증배관(photo multiplier) 설정을 조정하십시오. 최적의 이미징 설정이 결정되면, 시료 간에 설정을 변경하지 마십시오.

스캔 속도는 200 hertz로 설정하고, 4회의 라인 평균값을 수집하며, 핀홀 직경은 1 area unit으로 설정합니다. 신호 대 잡음비가 문제가 될 경우 핀홀 직경을 확장할 수 있습니다. 다만, 이로 인해 이미지 해상도가 일부 저하될 수 있습니다.

가능한 경우 컨포컬 이미지를 12비트 이상의 형식으로 수집하십시오. 이는 정량적 데이터 분석의 품질을 극대화하기 위함입니다. 모든 샘플에 대해 형광 단백질 채널과 BI arsenal 염색 채널의 이미지를 각각 수집하십시오.

데이터를 분석하려면 다음 플러그인이 포함된 Image J 소프트웨어를 사용하십시오. 1.32 C 이전 버전의 Image J를 사용하는 경우 다음 옵션을 클릭하십시오. 여러 이미지를 동시에 열 수 있도록 하려면, edit options input slash output에서 j file chooser to open slash share 사용 확인란을 클릭하십시오.

확인을 클릭하십시오. 분석할 이미지를 엽니다. 이미지마다 픽셀 강도가 다르기 때문에, Image J는 각 이미지에 대해 화면에 표시될 최대 및 최소 픽셀 강도를 자동으로 정의합니다.

이는 표시된 이미지들을 보는 그대로 비교할 수 없음을 의미합니다. 열린 이미지들이 모두 동일한 척도로 표시되도록 하려면, 볼 이미지의 상한 및 하한 픽셀 강도를 물리적으로 정의하십시오. 이 값들을 설정하려면, image 메뉴에서 brightness/contrast를 조정하십시오.

Set을 클릭하고, 표시될 최소값과 최대값을 정의하십시오. 그런 다음 'propagate to all open images'를 선택하고 확인을 클릭하십시오. 또는 특정 채널의 모든 이미지를 하나의 파일이나 스택으로 함께 배치하십시오.

그 후 Image J가 모든 이미지의 배율을 동일하게 자동으로 조정합니다. 이를 위해 'image stacks'에서 'images to stack'을 선택하고, 각 파일에 공통으로 적용될 이름을 입력한 후 'used titles as labels'를 선택하십시오. 확인을 클릭합니다.

분석을 위해 열려 있는 모든 이미지를 8비트로 변환하십시오. 이미지 유형을 8비트로 선택하면 표시 범위가 0에서 255 사이의 구간으로 재조정됩니다. 정보 손실이 발생하므로 기존의 12비트 이상의 고해상도 형식 위에 그대로 저장하지 않는 것이 중요합니다.

'다른 이름으로 저장' 옵션을 사용하여 'eight bit converted'라는 새 폴더에 복사본을 저장하십시오. 전체 이미지에서 bi arsal dye 결합 정도를 조사하는 한 가지 방법은 픽셀 강도 상관관계 플롯(pixel intensity correlation plot)을 수행하는 것입니다. 이 플롯은 한 채널의 모든 픽셀 값을 두 번째 채널의 해당 픽셀 값과 상대적으로 나타냅니다.

따라서 결합도가 높다면 GFP 형광이 강한 픽셀 위치에서 ash 형광 또한 강하게 나타날 것입니다. 픽셀 상호 상관관계를 분석하려면 8비트 REA 및 GFP 이미지가 ImageJ에 열려 있는지 확인하십시오. 그다음, Plugins > Image Correlator를 선택하여 이미지 상관분석 플러그인을 엽니다. 이미지 파일을 각각 Image 1과 Image 2로 지정하십시오.

그런 다음 확인을 클릭하십시오. 결과 스택에 상세 정보가 표시되지 않을 수 있으며, 이는 정상입니다.

scatterplots라는 새 폴더에 스택을 저장하고, 참조하는 샘플과 동일한 파일 이름을 지정하십시오. 예를 들어, Ash GFP Correlation plot입니다. 데이터를 확인하려면 다음 두 가지 옵션 중 하나를 선택하십시오.

먼저, process math log auto를 선택하여 데이터를 로그 형식으로 변환하십시오. 그다음 데이터를 시각적으로 재조정하기 위해 image adjust brightness slash contrast를 클릭하고 auto를 선택하십시오. 둘째, 낮은 값만 표시되도록 데이터를 시각적으로 재조정하고, 특수 룩업 테이블(LUT)을 사용하여 데이터를 표시함으로써 사용자 정의 LUT를 생성하십시오.

매우 간단한 LUT를 만들기 위해 이미지 색상 편집 LUT를 클릭하십시오. 왼쪽 상단 픽셀을 클릭하고 검은색을 선택하십시오. 그런 다음 오른쪽의 다음 픽셀을 선택하고 빨간색을 선택하십시오.

다음으로, 세 번째 픽셀을 클릭하고 마우스 버튼을 누른 상태에서 선택 영역을 오른쪽 하단 픽셀까지 드래그합니다. 빨간색을 선택하고 확인을 클릭한 후, 흰색을 선택하고 확인을 클릭합니다. 앞서 설명한 대로 밝기/대비 범위를 0에서 255로 설정하여 화면에 표시된 이미지로 고정합니다.

다른 프로그램으로 이미지를 복사하여 붙여넣으려면 RGB 형식으로 변환하십시오. 먼저, 앞서 설명한 대로 8비트 또는 16비트 이미지를 엽니다. GFP에 대해 LUT 색상 체계를 이미지에 할당하십시오.

이미지를 클릭하여 녹색 LUT를 할당합니다. 룩업 테이블(Look up tables) 녹색을 선택하십시오. 마지막으로 복사할 이미지를 선택하여 클립보드에 복사합니다. '편집 > 시스템으로 복사'를 선택하면, 이 그림은 30분 동안 염색한 GFP 및 TC 태그가 융합된 전형적인 kinase sock 결과를 보여줍니다.

HEC 2 9 3 세포에서 ash를 사용했을 때, ASH는 TC 태그가 부착된 표적 단백질에 높은 친화력으로 효율적으로 결합하는 것으로 보입니다. 반면, 이 그림은 GFP와 융합되었으나 TC 태그가 없는 SARK의 해당 대조군 샘플을 보여주며, 이는 TC 태그의 특이성과 배경 염색 수준을 모두 검증하는 데 필수적입니다. 이 결과는 RH가 TC 태그가 없는 표적 단백질과는 반응성이 없음을 보여주며, 이는 SSH 결합에 대한 TC 태그의 특이성을 나타냅니다.

이 절차를 수행할 때는 세포가 합류(confluence)되어 정체되지 않도록 하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 세포 내 V 결합에 영향을 줄 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 데이터를 정량적으로 분석하는 간단한 방법을 충분히 이해하게 될 것이며, 이러한 방법들을 개선하여 데이터 시각화를 위한 자신만의 고유한 IUTS를 개발할 수 있습니다.