Extraction d'ADN de haut poids moléculaire de tapis microbiens

L’objectif global de cette procédure est d’extraire de l’ADN de haut poids moléculaire à partir de tapis microbiens hyper salins. Ceci est accompli en homogénéisant et en extrayant d’abord les cellules microbiennes du tapis microbien. Les cellules microbiennes sont ensuite lysées à l’aide d’une méthodologie de congélation-décongélation et chimique.

Ensuite, il y a l’élimination des débris cellulaires et de l’ARN à l’aide d’extractions organiques et d’ARN, suivie de l’extraction de l’ADN. La dernière étape de la procédure est la précipitation et la purification de l’ADN. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent la qualité et la concentration de l’ADN de haut poids moléculaire.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les méthodes d’extraction directe et dure de l’ADN, est qu’elle utilise de l’ADN de haut poids moléculaire provenant d’un échantillon environnemental complexe pour des études métagénomiques fonctionnelles. Le mélange microbien utilisé dans cette étude a été obtenu à partir d’un étang hyper salin situé à Eleuthera, aux Bahamas, pour extraire les cellules microbiennes de la matrice du tapis de fond, mélangez d’abord environ 30 grammes de tapis à fond sans broyage, avec un pilon de broyage stérile. Le tapis est complètement homogénéisé lorsqu’il n’y a pas de grumeaux dans le mélange.

Ensuite, placez le matériau mat homogénéisé dans un mélangeur et ajoutez environ 100 millilitres de chlorure de sodium. Mélanger à vitesse moyenne pendant une minute, puis refroidir pendant une minute à moins 20 degrés Celsius. Répétez cette opération, en mélangeant et en refroidissant deux fois de plus lorsque le mélange est terminé, transférez la boue dans une bouteille centrifuge de 250 millilitres et remplissez le volume vide restant avec une molaire de chlorure de sodium.

Agitez à température ambiante pendant 30 minutes après 30 minutes, centrifugez la boue à basse vitesse pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, transférez doucement le surnageant dans une fiole en perturbant le moins possible les sédiments. Ajoutez du chlorure de sodium frais au sédiment granulé.

Mélangez à nouveau et secouez pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez comme précédemment et transférez le surnageant dans une nouvelle fiole. Répétez l’ajout de chlorure de sodium frais, la centrifugation par mélange et l’élimination du surnageant trois fois de plus.

Combinez les surnageants des cinq extractions cellulaires et des aliquotes de centrifusion de 200 millilitres à grande vitesse pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et remettez en suspension chaque pastille cellulaire dans 10 millilitres d’hexamétaphosphate de sodium. Combinez les suspensions cellulaires des quatre tubes et ajoutez de l’hexamétaphosphate de sodium pour porter le volume à 200 millilitres.

Lavez les cellules en les secouant à température ambiante pendant 30 minutes. Après avoir secoué les cellules de centrifugation à grande vitesse pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 200 millilitres de cellules de lavage, à nouveau en agitant à température ambiante pendant 10 minutes. Enfin, centrifugez à nouveau à grande vitesse pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Après avoir jeté le snat Resus, suspendre la pastille cellulaire dans 15 millilitres de pour préparer 200 aliquotes microlitres de cellules microbiennes. Les cellules microbiennes peuvent être stockées à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires pour les extractions d’ADN. Pour commencer la procédure d’extraction et de purification de l’ADN des cellules microbiennes, ajoutez du chlorure de sodium SDS et de l’éthanol beamr capto à chacune des cellules microbiennes de 200 microlitres.

Aliquotes huit tubes au total. Mélangez doucement en inversant quatre à six fois, immergez le mélange dans l’azote liquide pendant deux minutes, puis décongelez à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes, répétez l’immersion dans l’azote liquide et décongelez à 65 degrés Celsius. Deux fois de plus.

Prolongeant la décongélation finale à 10 minutes. Après le troisième tour de congélation et de décongélation, ajoutez 200 microlitres d’acétate de potassium dans chaque tube et placez-le sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, centrifugez à 10 000 GS pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, utilisez une pointe de pipette à large alésage pour transférer le surnageant dans un nouveau tube. Ajoutez trois microlitres d’ARN A et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l’incubation d’une heure, ajoutez un volume égal de chloroforme.

Agiter brièvement par inversion et centrifuger à 15 000 G pendant 10 minutes. À température ambiante, transférez la couche supérieure de surnageant dans un nouveau tube. Répétez la procédure d’extraction au chloroforme.

Encore une fois, transférez la couche supérieure de surnageant dans un nouveau tube. Ajoutez un volume égal d’isopropanol réfrigéré au surnageant et incubez sur glace pendant 30 minutes. Pour précipiter la centrifugeuse d’ADN à la vitesse maximale, pour granuler l’ADN, jetez le surnageant et lavez chaque pastille d’ADN avec un millilitre d’éthanol réfrigéré.

Répétez l’opération de lavage centrifuge à 70 % d’éthanol à vitesse maximale pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant. Répétez le lavage à l’éthanol à 70 % et faites sécher la pastille d’ADN à l’air libre pendant 10 minutes.

Remettez en suspension chaque pastille d’ADN dans environ 25 microlitres de te. Réchauffez à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis combinez dans un tube et augmentez le volume à 500 microlitres avec te. Ajouter le polyéthylène glycol mélangé doucement par inversion et incuber sur glace pendant 10 minutes.

Centrifugeuse pour granuler l’ADN. Ensuite, retirez et jetez le surnageant après avoir lavé l’ADN avec du froid. 70 % d’éthanol sèche à l’air pendant 10 minutes et 30 à 50 microlitres d’eau TE ou de qualité moléculaire et chaude à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Stockez l’ADN à moins 80 degrés Celsius. Ce tableau montre les résultats de la mesure de la concentration et de la qualité de l’ADN extrait du tapis microbien hyper salin. Le protocole a produit environ deux microgrammes d’ADN par gramme d’échantillon de tapis avec un rapport A deux 60 à deux 80 de 1,6 et un rapport A deux 60 à deux 30 de 0,7.

Bien que le rapport A deux 60 à deux 30 semble être faible, aucune inhibition des applications moléculaires en aval telles que l’amplification par PCR des gènes de l’ARN ribosomique 16 s n’a été observée dans une étude distincte lorsque la taille de l’ADN a été déterminée à l’aide de l’électrophorèse sur gel à champ pulsé, les résultats indiquent un poids moléculaire élevé ou H-M-W-D-N-A d’environ 35 à 50 kilobases. Ici, la voie M est un marqueur HMW et les voies un et deux sont des répliques de l’ADN métagénomique extrait du tapis hyper salin d’eleutha. Les taches d’ADN de plus de 35 kilobases peuvent être excisées et purifiées pour le clonage de vecteurs à inserts importants ou d’autres applications moléculaires appropriées.

Après cette procédure, d’autres méthodes telles que le clonage P-C-R-D-G-G ou le séquençage de l’ADN peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la diversité fonctionnelle de la communauté microbienne étudiée.