הכנת Pyrophosphates אינוסיטול איכות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר ולטהר פירופוספט באיכות טובה ונול. זה מושג על ידי שימוש ראשון ב-IP 6 כמצע ל-IP 6 קינאז, אנזים אחד ליצירת IP 7. לאחר מכן, התגובות האנזימטיות נטענות על ג'ל פוליאמיד והרצועה המתאימה ל-IP 7 נכרתת.

לאחר מכן, ה-IP 7 מבודד על ידי מחזורי התייבשות עוקבים. השלב האחרון בהליך הוא אישור טוהר המוצר וקביעת הריכוז. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את הפעילות הביולוגית של IP 7 באמצעות דגירה של IP 7.

עם VIP קינאז אחד ועם IP שבע פוספטאז DDP אחד, תגובות אלה מייצרות IP שמונה ו-IP שש בהתאמה. עשה זאת Met יכול לספק תובנה לגבי איתות IP 7. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות, כגון בחלק של פוספטים כמו IP 8 או ה-IP 5 נגזר PPIP ארבע.

פרוטוקול זה מתחיל בהכנת תגובות אנזימטיות שבהן IP שש קינאז אחד או VIP אחד ממיר IP שש לאיזופורמים הקשורים לפיירו פוספו. לצורך הדגמה זו, אנזימי היסטמין מתויגים IP 6, קינאז אחד ו-GST מתויגים VIP אחד טוהרו מ-e coli על פי הליך שתואר קודם לכן. כדי להתחיל, הכינו 10 עד 20 תגובות אנזימטיות עצמאיות המכילות IP 6 ו-IP 6 קינאז אחד או GST VIP אחד כמתואר בפרוטוקול הכתוב.

כוונן את עוצמת הקול ל-50 מיקרוליטר עם מים מזוקקים כפולים של מילי Q. לאחר סיבוב קצר של הצינורות, דגרו את התגובות ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם סיבוב. הכן את מנגנון הג'ל פולי אקרילאמיד באמצעות לוחות זכוכית באורך 24 ס"מ, רוחב 18 ס"מ, חללים ברוחב 1.5 מילימטר ומסרק 16 נתיבים.

לאחר מכן, שפכו תמיסת ג'ל שהוכנה בעבר בין לוחות הזכוכית היצוקים מראש בנפח של 50 מיליליטר לג'ל. הכניסו את המסרק ותנו לג'ל להתפלמר במשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שהג'ל התפלמר, העבירו את המנגנון לחדר הקירור.

הפעל מראש את הג'ל בפעם אחת TBE למשך כ-30 עד 60 דקות ב-200 עד 300 וולט, בינתיים בפעם אחת צבע G כתום. לכל תגובה, הכינו דגימת בקרה סטנדרטית המכילה שני מול של IP 6. לאחר הריצה המוקדמת, יש לשטוף כל באר ביסודיות עם מאגר רץ.

השתמש במזרק המחובר למחט בגודל 21 כדי להסיר משקעים. לאחר מכן טען את הדגימות לתוך הג'ל, הימנע מהעמסת שני הנתיבים הראשונים והאחרונים של הג'ל. לבסוף, הפעל את הג'ל למשך הלילה בשבעה מיליאמפר לג'ל עד שרצועת הצבע G הכתומה נמצאת בטווח של 10 הסנטימטרים האחרונים מתחתית הג'ל.

כדי להתחיל בבידוד של IP שבע, פרק את מכשיר הג'ל והסר בזהירות צלחת זכוכית אחת והשאיר את הג'ל על השנייה. חותכים חלק קטן מהג'ל ממש מעל רצועת ה-GD הכתומה לתחתית, כולל תקן IP 6 ונתיב דגימה אחד. מכתימים את החלק החתוך של הג'ל בכחול טולואידין למשך מספר דקות עד להופעת רצועת הפירופוספט של אנטול.

בינתיים, הנח את צלחת הזכוכית שהוסרה בעבר בחזרה על גבי הג'ל על מנת למנוע התייבשות של הג'ל הלא מוכתם. העבירו את החלק המוכתם של הג'ל לתמיסת צביעה DES למשך מספר דקות על מנת לשטוף את כל העודפים של כחול טולואידין, ולאחר מכן מקמו מחדש את הג'ל עם הג'ל הלא מוכתם. פס ה-IP שבע אמור להיות גלוי מכיוון שהוא פועל מעט לאט יותר מה-IP 6 סטנדרטי A TP, שרץ מהר יותר מ-IP 6 אמור להיות גלוי גם כן.

לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את רצועת ה-IP שבע על החלק הלא מוכתם של הג'ל. נצל את מיקום הנדידה של ה-IP שבע שנקבע עם ג'ל הכתמים. כדי להעריך את המיקום של רצועת ה-IP Seven, הכניסו את רצועת ה-IP שבע שנחתכה מהג'ל לתוך שפופרת של 15 מיליליטר והוסיפו 10 מיליליטר מים מזוקקים כפולים של מילי Q.

סובב את הצינורות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה, השליך את הנוזל על ידי סילוק כדי להסיר עודפי TBE וחלקיקי אקרילאמיד מיקרוסקופיים. לאחר מכן בצע שני מחזורי התייבשות על ידי הוספת חמישה מיליליטר של 50% מתנול לצינור המכיל את ג'ל ה-IP Seven. סובב את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.

לאחר מכן העבירו את פרוסת הג'ל לצינור חדש של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר מים מזוקקים כפולים מילי Q וסובבו בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. שמור את השפופרת המכילה מתנול לשימוש נוסף לאחר הדגירה. חזור על מחזור ההתייבשות פעם נוספת כדי לרכז את ה-IP 7 המנומק.

שלב את חמשת מיליליטר המים שנוספו בעבר וחמישה מיליליטר של 50% מתנול. יבש את התמיסה המשולבת באמצעות שואב אבק מהיר המחומם ב-60 מעלות צלזיוס. לאחר שהדגימות כמעט יבשות, העבירו את הנוזל הנותר לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

סובב את הצינור במשך שתי דקות של 5,000 סיבובים לדקה. אסוף את ה-SUP natant והשאיר את 20 עד 30 המיקרוליטר התחתונים מכיוון שהוא עשוי להכיל חלקיקי אקרילאמיד. העבירו את הדגימה לצינור צנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר.

במידת הצורך, המשך בתהליך הייבוש באמצעות שואב מהירות לא מחומם. השחזור של IP 7 מצטמצם באופן דרמטי אם הדגימות מתייבשות לחלוטין. לכן, חובה לסיים את תהליך הייבוש כאשר הדגימות מגיעות לנפח של 100 עד 300 מיקרוליטר.

לאחר שחזור ה-IP 7 המבודד, טען שניים עד חמישה מיקרוליטרים מהדגימה על ג'ל עמוד כדי לקבוע את ריכוזו וטוהרו. טען מספר דילול של IP שש כתקני ריכוז וארבעה מול של סמן פוליפ. לאחר הפעלת הג'ל, דמיין את האיזופורמים הראשוניים של פירופוספט על ידי צביעה וצביעה של הג'ל כולו בתמיסה כחולה טולואידין.

בעקבות ההליך שתואר זה עתה לאחר צביעת טולואידין, ניתן לקבוע את הריכוזים על ידי סריקת הג'ל והשוואת ההבדלים בעוצמה בין IP 6 ל-IP 7. באמצעות תוכנת הדמיה כגון Image J, ההמרה האנזימטית ההכנה של IP 6 ל-IP 7. באמצעות IP שישה קינאז אחד ו- VIP אחד ניתן לפתור בקלות אנזימים באמצעות ניתוח דפים.

העמסת IP 6 כבקרת גודל יחד עם צביעת ג'ל כחול טולואידין מאפשרת זיהוי של נגזרות זרחניות פירו. מכיוון שהם פועלים לאט יותר, בהתאם למספר קבוצות הפוספט הקיימות בהתחלה, ההליך המתואר לעיל הביא לטיהור קל של IP 7. יתר על כן, ניתוח של האנטול פירופוספט המטוהר לפי עמוד חשף את טוהר ה-IP 7.

מעניין לציין כי איזומר אחד שלושה פירופוספט IP חמש של תוצר ה-IP שבע של VIP אחד נודד מעט לאט יותר מאיזומר חמשת הפירוספטים IP חמש של VIP שבע שנוצר על ידי IP שש קינאז אחד. השימוש בתקני IP 6 מאפשר לכמת בקלות את ריכוז ה-IP המטוהר שבע לפני השימוש ב-IP 7. לניסויים נוספים ניתן להעריך את פעילותו הביולוגית. חמש.

פירופוספט IP 5 מודגר עם FIP אחד ועם IP 7 פוספטאז DDP אחד באופן שגרתי. ה-IP המטוהר שבע מומר ל-IP שמונה על ידי VIP אחד ול-IP שש על ידי DDP אחד. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו טולין ממושך בצביעה כחולה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו בידוד IP 8 או זרחן אחר בצורות איזופורמים.