Fazlararası Hücre Çekirdek Mekanik Özellikleri Probe Biyofiziksel Tahliller: Yüzey Gerilme Uygulama ve Microneedle Manipülasyon

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, arayüz hücre çekirdeğinin mekanik özelliklerini ve çevredeki hücre iskeleti ile fiziksel bağlantısını ölçmektir. Bu, şeffaf bir silikon membran üzerine kaplanmış hücrelere mekanik gerilme uygulanarak ve indüklenen nükleer deformasyonların görüntülenmesiyle elde edilir. Artan nükleer deformasyonlar, azalmış nükleer sertliğe karşılık gelir, çünkü çekirdek, hücre iskeleti eşleşmesindeki değişiklikler de indüklenen nükleer deformasyonları etkileyebilir.

Hücre iskeleti ve çekirdek arasındaki hücre içi kuvvet iletimi, hücre iskeletine lokalize zorlanma uygulanarak doğrudan incelenir. Floresan olarak işaretlenmiş NU nükleer ve hücre iskeleti yapılarının yer değiştirmesi daha sonra görüntülenir. Hücre çekirdeğinin çevredeki hücre iskeletine göre sertliğini gösteren sonuçlar elde edilir.

Substrat gerinim deneylerine dayanarak, mikroiğne manipülasyon testi, nükleo hücre iskeleti eşleşmesinin bozulmasının hücre içi kuvvet iletiminde kusurlara neden olduğunu ortaya koymaktadır. Bu tekniklerin, izole edilmiş çekirdeklerin mikro pipet aspirasyonu gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, normal hücresel mimariyi bozmadan nükleer mekaniğin ve bozulmamış canlı hücrelerin ölçümlerini mümkün kılmasıdır. Bu yöntemler, nükleer zarf bileşimindeki değişikliklerin çekirdeğin mekanik özelliklerini nasıl etkileyebileceğine dair fikir verebilir.

LA nöropatileri veya kanser gibi hastalıklar bağlamında nükleer mekaniğin rolünü incelemek için de uygulanabilirler. Her bir gerinim kabı, üç inç çapında özel yapım bir dipsiz plastik tabaktan ve hücre kültürü substratı olarak işlev gören bir silikon zarı tutmak için plastik bir O-ringden oluşur. Gerinim kabının hazırlanması için, bir O-ring ile çanak arasına dört inç'e dört inçlik bir silikon zar parçası sıkıştırın, fazla zarı dikkatlice kesin, gerinim kabını deiyonize su ile durulayın ve ardından silikon zarı hücre dışı matris molekülleri ile kaplamadan önce çanağı otoklavlayın, alt merkezdeki zarın dışında bir referans noktası işaretleyin.

Bu dönüm noktası, tek eksenli gerinim uygulaması için gerinim deneyleri sırasında aynı hücrelerin tanımlanmasına yardımcı olacaktır. Membranın oluşumunu tek boyutta sınırlamak için referans noktasının etrafına iki paralel bant şeridi uygulanır. Optimal hücre bağlanmasını sağlamak için, silikon zarları mililitre başına üç mikrogram fibronektin veya herhangi bir uygun hücre dışı matris proteini ile kaplayın.

Süzme kabını ters çevrilmiş 10 santimetrelik bir polistiren tabakla örtün ve ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Fazla proteini çıkarmak için zarı PBS ile bir kez durulayın. Çanağı 10 mililitre büyüme ile doldurun, orta ve bir kenara koyun.

Kaplanmış silikon membran kabı hazırlandıktan sonra, tripsin% 0.05 tryin ile hücreleri gözler ve tabağa yapışan bir hücre tohumlar. Büyüme ortamında. Bu prosedür fare embriyonik ile gösterilmiştir.

Fibroblastlar veya mes, normal kültür koşulları altında hücreleri 24 ila 48 saat inkübe eder. Substrat gerinim deneyleri için donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop, mikroskop aşamasına uyan bir taban plakasından oluşan bir gerinim cihazı içerir. Plaka, silikon zarın orta kısmına gerilme uygulamaya yarayan merkezi bir silindirik platin tutar.

Cihaz ayrıca, gerinim kabını tutan ve bir yük uygulamak için beş poundluk bir ağırlığın yanı sıra dört kılavuz pim üzerinde yukarı ve aşağı kayabilen hareketli bir plakaya sahiptir. Çekirdekleri görselleştirmek için, gerinim kabındaki hücreleri, 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca mililitre çengelli leke başına bir mikrogram ile inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı aspire edin ve 15 mililitre fenol kırmızısı serbest büyüme ortamı ile 25 milimolar heis ile değiştirin.

Daha sonra çanağı tabak tutucuya vidalayın ve zarın merkezi Platin boyunca kaymasını sağlamak için silikon zarın tabanının çevresine dikkatlice gres sürün. Membranın orta kısmını temiz tuttuğunuzdan emin olun. Taban plakasını mikroskop tablası plakasına yerleştirin ve tabak tutucuyu dikkatlice taban plakasına monte edin.

İlk dinlenme konumunda, gerinim kabının silikon zarının merkezi platin üzerinde gevşek bir şekilde durduğundan emin olun. Ardından, silikon zarın altına odaklanın ve merkezi siyah referans noktasını bulun. Nokta, tüm görüntü alımları için başlangıç noktası görevi görecek ve germe sırasında ve sonrasında aynı hücrelerin bulunmasına yardımcı olacaktır.

Bu görüntüde, ortadaki nokta tüm görüş alanını doldurur. Noktanın kenarlığından başlayarak, hücreleri ve silikon zarın üst kısmını görselleştirmek için odağı ayarlayın. Merkezi olarak yerleştirilmiş çekirdeklere sahip iyi yayılmış hücreleri bulun.

Hücre taslağına ve silikon zara odaklanması gereken bir yüz kontrast görüntüsü elde edin. Ardından, çekirdeğin merkezi düzlemine odaklanması gereken nu nükleer kanca boyasının bir floresan görüntüsünü elde edin. Beş ila 15 hücrenin görüntülerini aldıktan sonra, merkezi noktaya geri dönün.

Ağırlığı süzüntü kabına yavaşça uygulayın, bu da homojen gerinim uygulaması sağlar. Yemeğin ortasında. Maksimum uygulanan alt tabaka gerilimi, gerinim uygulamasını takiben dikey hizalama pimlerine yerleştirilen naylon ara parçalarla sınırlıdır, silikon zarın altına odaklanın ve noktadan başlayarak referans noktasını tekrar bulun.

Aynı hücrelerin yerini değiştirin ve tekrar, ilk görüntülerin odak düzlemlerini yakından eşleştirmeye çalışarak, tam zorlanma altında çekirdekteki her hücrenin bir faz kontrastı, floresan sonu görüntüsü elde edin. Bu işlem, hücrenin garip substrata aktif olarak yeniden şekillenmesini ve adaptasyonunu önlemek için 10 dakikayı geçmemelidir. İlgili tüm görüntüler elde edildikten sonra, mikroskop aşamasını başlangıç noktasına geri getirin.

Ağırlığı tabak tutucu plakadan dikkatlice çıkarın ve gerekirse silikon zarın gevşemesine izin verin. Süzme kabını başlangıç konumuna gelene kadar yavaşça yukarı itin. Daha sonra faz kontrastı ve floresan elde edin.

Gerinim sonrası hücrelerin görüntüleri, gerinim görüntüleri için tarif edildiği gibi, gerinim uygulaması öncesinde, sırasında ve sonrasında hücrelerin ve floresan etiketli çekirdeklerin görüntüleri, normalleştirilmiş nükleer suşu hesaplamak için analiz edilir. Bu gösterimde, analiz için özel olarak yazılmış bir MATLAB komut dosyası kullanılmıştır, ancak uygulanan substrat gerinimini, karşılık gelen tam öncesi ve gerinim sonrası görüntüler arasında zar üzerinde bulunan üç ila altı kontrol noktasının konumlarını manuel olarak eşleştirmek için birkaç alternatif seçenek mevcuttur. MATLAB programı daha sonra, ön gerinim ve tam gerinim görüntüleri arasındaki eşleşen kontrol noktalarının konumlarını karşılaştırarak uygulanan membran gerinimini hesaplar.

Konumlar ayrıca gerinim öncesi ve gerinim sonrası görüntüleri arasındaki artık gerinim için de karşılaştırılır. Kontrol noktaları, hasarlı veya ayrılan hücrelerin tespit edilmesine yardımcı olacak görüntü çiftlerini kaydetmek için aynı anda kullanılır. Ardından, her bir çekirdek için nükleer gerilimi hesaplayan ayrı bir MATLAB programı kullanarak çekirdekleri manuel olarak seçin.

Bu, karşılık gelen tam öncesi ve gerinim sonrası floresan görüntüler arasındaki nükleer boyutun eşleştirilmesiyle veya farklı deneyler arasında uygulanan membran gerinimindeki küçük varyasyonları hesaba katmak için intra nükleer belirteçlerin eşleştirilmesiyle elde edilir. Sonuçlar normalleştirilmiş nükleer suş olarak ifade edilir. Bu, indüklenen nükleer suşun, her bir çekirdek için hesaplanan uygulanan zar suşuna oranı olarak tanımlanır.

MATLAB komut dosyaları talep üzerine kuzulama laboratuvarından temin edilebilir. Son adım olarak, her bir çekirdek doğrulanır ve suş uygulaması sırasında ayrılan veya hasar gören hücrelerden yapılan ölçümler hariç tutulur. Silikon membran üzerinde iki farklı alana yayılmış MEF'ler, %20 UNI eksenel gerinimin uygulanmasından önce, sırasında ve sonrasında faz kontrastı ve floresan mikroskobu ile görüntülendi, burada gösterilen, gerinim uygulamasından herhangi bir hasar veya ayrılma olmadan hayatta kalan hücrelerden alınan geçerli çekirdeklerle başarılı bir deney örneğidir.

Buna karşılık, burada gösterilen hücreler, suş uygulaması sırasında geri çekildi veya kısmen ayrıldı ve analizden çıkarıldı. Sol taraftaki hücre, hücre iskeleti hasarı ve nükleer çökme belirtileri gösterirken, sağ taraftaki hücre suş uygulaması sırasında kısmen ayrılır ve geri çekilir. Bu, aşırı zorlanmanın bir göstergesi olabilir.

Burada, Lamin AC eksikliği olan farelerin farklı meth hücre hatlarından oluşan bir panelde normalleştirilmiş nükleer suşun bir analizi, hücrenin ektopik olarak ya boş bir vektörü ya da vahşi tip lamin A'yı, vahşi tip çöp arkadaşlarından gelen mitlere kıyasla eksprese ettiğini, nükleer zarf proteinlerinin ekspresyon kaybını göstermektedir. Lamin AC, normalize nükleer suşun artmasına neden olur. Bu, vahşi tip Lamin'in yeniden eklenmesiyle kısmen veya tamamen geri yüklenebilen azalmış nükleer sertliğin göstergesidir A.To mikroiğne manipülasyon deneyine hazırlanın, inkübasyonu takiben 37 santigrat derecede iki saat boyunca düşük konsantrasyonda fibronektin içeren 35 milimetrelik bir cam alt hücre kültürü kabını inkübe edin, kabı HBSS ile iki kez yıkayın ve tabağa iki mililitre büyüme ortamı ekleyin.

Daha sonra fare embriyonik fibroblastları% 0.05 tripsin ile inize edilir ve iki mililitre büyüme ortamında fibronektin kaplı cam alt tabağa büyüme ortamında ekilir. Tek A'ya yapışan akıcı olmayan hücreler elde etmek için, hücreleri lekelemek için gece boyunca inkübatöre geri koyun, büyüme ortamına MIT izleyici mitokondriyal boyası ve kancalı nükleer boyası ekleyin. Bu büyüme ortamını hücrelere ekleyin ve inkübasyon ile devam edin.

Daha sonra, hücreleri Hank'in tamponlu tuzlu tuzunda oda sıcaklığında beş dakika inkübe ederek yıkayın. Daha sonra 25 milimolar ile fenol kırmızısı içermeyen büyüme ortamı ekleyin. Görüntüleme için hücrelere parça veriyor.

Mikroiğne deneyi için, önceden çekilmiş bir mikroiğneyi, dijital şarj bağlantılı bir cihazla ters çevrilmiş bir mikroskoba bağlı bir mikro manipülatöre yerleştirin. Mikroiğneyi tek bir hücrenin yakınına kamera ve odaklayın. Hücre iskeletine yerleştirilen mikroiğne olmadan tek hücrenin bir görüntüsünü elde edin.

Faz kontrastında, kanca 3 3, 3 4 2 boyasının bir floresan görüntüsü ve mikro manipülatör kullanılarak ters çevrilmiş bir mikroskop üzerinde 60 x objektif ile mitokondriyal boyanın bir floresan görüntüsü, mikroiğneyi nükleer çevreden sabit bir mesafede bir hücrenin sitoplazmasına dikkatlice yerleştirin ve bir faz kontrast görüntüsü alın, kancaların bir floresan görüntüsü. 3 3, 3 4, 2 leke ve mitokondriyal lekenin bir floresan görüntüsü. Her 10 saniyede bir otomatik olarak görüntü alırken, bilgisayar kontrollü mikro manipülatörü kullanarak mikroiğneyi saniyede bir mikrometre hızla hücre çevresine doğru belirli bir mesafeye hareket ettirin.

Mikroiğne hücre çevresine doğru belirli bir mesafeye hareket ederken, tutarlı mikro manipülasyon elde etmek için mikro manipülatör bir bilgisayar aracılığıyla kontrol edilmelidir. Prosedürler son olarak, mikroiğne hücre iskeletinden çıkarıldıktan sonra görüntüler elde eder; mikroiğne manipülasyonu öncesinde, sırasında ve sonrasında elde edilen çekirdek ve hücre iskeletinin floresan olarak etiketlenmiş özelliklerinin görüntüleri, küçük hücre içi bölgelerin yer değiştirmesini hesaplamak için analiz edilir. Bu gösterimde, analiz için özel olarak yazılmış bir MATLAB komut dosyası kullanılır, ancak başka birkaç seçenek de mevcuttur.

MATLAB komut dosyası, mikroiğne tarafından üretilen yer değiştirmeyi ölçmek için talep üzerine kuzulama laboratuvarından temin edilebilir. MATLAB programı, floresan etiketli özelliklerin orijinal konumu ile yeni tanımlanan konumları arasındaki geçişi hesaplamak için normalleştirilmiş bir çapraz korelasyon algoritması kullanır. Yer değiştirme daha sonra vektör haritaları olarak görüntülenir ve sayısal değerler olarak saklanır.

Bir sonraki adım, matlab ile hücre iskeleti veya çekirdek içindeki ortalama yer değiştirmeleri belirlemek için elde edilen yer değiştirme vektör haritalarını kullanmaktır. İlk olarak, suş uygulama bölgesinde hücre iskeleti içinde üç veya daha fazla nokta seçin. Yer değiştirme vektör haritasında, mikroiğne uygulaması sırasında oluşan uygulama bölgesinin yakınındaki hücre iskeleti gerilme miktarını belirlemek için ortalama sayısal değeri alın.

Ardından, gerinim uygulama bölgesinin yakınındaki çekirdek içinde üç veya daha fazla nokta seçin ve ortalama değeri alın. Bu değer, mikroiğne uygulama bölgesinin yakınındaki nükleer gerinim miktarını temsil eder. Aynı yöntemi kullanarak, bu ilgili bölgelerde seçilen noktalardan gerinim uygulama bölgesinden uzaktaki nükleer ve hücre iskeleti suşunu belirleyin.

Hücre içi kuvvet iletimini ölçmek için bir mikroiğne manipülasyon testi yapıldı. Burada, mavi nükleer leke ve MIT izleyici yeşil mitokondriyal boya ile etiketlenmiş bir fibroblastın faz kontrast görüntüleri ve floresan görüntüleri gösterilmiştir. Hücre iskeletine çekirdekten belirli bir mesafede bir mikro iğne yerleştirildi ve daha sonra hücre çevresine doğru hareket ettirildi.

Mitokondriyal yer değiştirme, hücre iskeleti zorlanması öncesinde, sırasında ve sonrasında uzar ve daha sonra yer değiştirme vektörler olarak çizilir. Her vektör, orijinal konum ile yeni tanımlanan konum arasındaki kayma olarak hesaplanan yer değiştirmeyi temsil eder. Düşük görüntü yoğunluğuna veya yetersiz dokuya sahip bölgeler analizden çıkarıldı.

Hücre iskeleti ve nükleer yer değiştirme daha sonra hem kontrol fibroblastları hem de fibroblastlar için suş uygulama bölgesinden artan mesafelerde belirli alanlarda ölçüldü. Bozulmuş bir nükleo hücre iskeleti eşleşmesi ile sağlam nükleoya sahip hücrelerde hücre iskeleti birleştirme kuvvetleri tüm hücre boyunca iletilir ve bu da suş uygulama bölgesinden yavaşça dağılan indüklenmiş nükleer ve hücre iskeleti deformasyonu ile sonuçlanır. Buna karşılık, bozulmuş nükleo hücre iskeleti eşleşmesine sahip hücreler, uygulama bölgesinin yakınında lokalize yer değiştirme ve daha uzakta çok az indüklenmiş deformasyon gösterir.

Mikroiğne yerleştirme bölgesinde karşılaştırılabilir hücre iskeleti gerilmesi uygulaması, hem kontrol fibroblastları hem de bozulmuş nükleo hücre iskeleti eşleşmesi olan fibroblastlar için gözlenir. Bununla birlikte, diğer bölgelerde indüklenen nükleer ve hücre iskeleti yer değiştirmesi, bozulmuş çekirdek hücre iskeleti eşleşmesi olan fibroblastlarda kontrol hücrelerine göre önemli ölçüde daha küçüktü. Bu nedenle, gerinim uygulama bölgesinden uzakta hücre iskeleti ve nükleer yer değiştirmede bir azalma, hücre iskeleti ve çekirdek arasındaki zorla iletimin bozulduğunu gösterir.

Bu videoyu izledikten sonra, nükleer mekaniğin ve çekirdek ve hücre iskeleti arasındaki hücre içi kuvvet iletiminin nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu teknikleri, nükleer zarf proteinlerindeki mutasyonların etkisini veya gelişim sırasında veya kanserde meydana gelen nükleer zarf bileşimindeki değişiklikleri incelemek için kullanabilirsiniz.