Брыжеечной артерии Сокращение и отдых Исследования с помощью автоматизированной миография провода

В данной процедуре используются крысы линий с повышенной и пониженной чувствительностью к соли для сравнения реактивности мезентериальных артерий сопротивления на внеклеточный кальций при натяжении, вызванном фенилэфрином. Для этого сначала выделяют мезентериальную аркаду из организма животных и препарируют ветви артерий сопротивления. Затем первую из двух проволочек из нержавеющей стали продевают через короткий сегмент препарированной артерии, после чего сосуд закрепляют в камере для регистрации графиков.

Затем вторую проволоку из нержавеющей стали продевают через просвет сосуда параллельно первой проволоке. Далее закрепленный сосуд растягивают до нормализованной внутренней окружности. Заключительным этапом процедуры является реактивация сосуда путем его стимуляции повторными введениями фенилэфрина и расслабления с помощью кумулятивного введения кальция.

В конечном счете, результаты демонстрируют изменения напряжения в сосуде, которые можно преобразовать в кривую кальциевого ответа и использовать для определения значений EC 50. Для сравнения: идея использовать этот метод возникла у нас, когда мы обнаружили, что нервная сеть крысиных мезонефральных тел экспрессирует gpro-сопряженный кальций-чувствительный рецептор.

Это можно изучать таким же образом, как и горькие рецепторы AIC, которые активируются агонистом. Как правило, лицам, впервые осваивающим данный метод, может быть сложно, поскольку слои эндотелия и гладких мышц очень тонкие. Сосуды легко повреждаются.

Если это происходит, механические свойства этих сосудов могут быть нарушены. Для начала подготовьте рабочую область и хирургические инструменты. Положите анестезированное животное на спину и протрите живот спиртом.

После выполнения срединной лапаротомии с помощью ножниц удалите около 85 сантиметров кишечника, включая верхнюю брыжеечную артерию. Отсеките проксимальный конец близко к привратнику (пилорусу), а дистальный — рядом с илеоцекальным сочленением. Поместите иссеченный участок в покрытую чашку Петри с физиологическим раствором или PSS при комнатной температуре.

Закрепите проксимальный конец кишечника булавкой справа, затем закрепите остальную часть кишечника, двигаясь против часовой стрелки. Далее выделите сегмент брыжеечной артерии, содержащий вторую и третью ветви, и участок кишечника со стороны проксимального конца. Найдите V-образную точку ветвления брыжеечной артерии и отделите ее от вены.

С помощью пинцета осторожно удалите жировую и соединительную ткани, чтобы избежать прямого контакта с артерией. Для начала закрепления сосуда вырежьте два сегмента артерии длиной около 2 mm. Для раскрытия просвета артерии можно использовать кончик стальной проволоки без содержания вольфрама длиной 4 cm и диаметром 40 µm.

Затем с помощью тонкого пинцета введите проволоку в просвет каждой артерии. Осторожно, чтобы не повредить эндотелий, заполните камеру с миографтом PSS при температуре 37 °C. Используя пинцет, перенесите сегмент сосуда с введенной проволокой в камеру.

Затем перенесите иссеченный проксимальный сегмент сосуда в камеру миографа и потяните за конец проволоки, чтобы ввести её в сосуд. Избегайте растяжения сосуда. Закрепите ближний конец проволоки против часовой стрелки под ближайшим фиксирующим винтом на правой зажимной губке, соединенной с микрометром.

Захватите свободный конец проволоки пинцетом и закрепите его по часовой стрелке под дальним фиксирующим винтом на правой губке; убедитесь, что сегмент сосуда вдоль проволоки расположен в зазоре между губками, не касаясь самой губки. Раскрутите губки в разные стороны. Расположите вторую проволоку параллельно сосуду и введите ее в дальний конец просвета.

Осторожно и плавным движением проведите проволоку через просвет сегмента сосуда, используя уже установленную проволоку в качестве направляющей. Держите проволоку примерно в одном сантиметре от сосуда, чтобы избежать её растяжения во время манипуляции и не касаться эндотелия. Стяните губки зажима и убедитесь, что вторая фиксирующая проволока проходит под первой, закрепленной с правой стороны.

Закрепите ближний конец второго провода по часовой стрелке под ближним фиксирующим винтом левой губки, соединенной с преобразователем. Закрепите дальний конец провода под фиксирующим винтом на левой губке и затяните его, чтобы натянуть провод. После завершения монтажа дайте системе стабилизироваться в течение 30 минут при 37 °C.

После уравновешивания мотор сбрасывается через меню крепления, и инициируется процедура нормализации, в ходе которой сосуд растягивается до нормализованной внутренней окружности. Для начала откройте меню нормализации и установите целевое трансмуральное давление на 13.3 kilopascals. Затем установите продолжительность каждого этапа нормализации на 60 seconds.

Отношение IC one к IC 100 должно быть равно 0,9, а калибровка IP должна быть установлена на значение two star delta. Измерьте длину закрепленной брыжеечной артерии, используя показания окуляра микроскопа, когда перекрестия находятся над дальним и ближним концами сегмента сосуда. После нормализации активность сосудов восстанавливают путем выполнения стандартного запуска, состоящего из серии стимуляций и периодов промывки.

Сначала установите крышку миокамеры и начните аэрацию смесью 95% воздуха и 5% углекислого газа. Заполните камеру свежим раствором PSS, содержащим 100 µM аскорбиновой кислоты. Вызовите сокращение сосуда с помощью 5 µM феннилина, риналола или PE в течение пяти минут, затем четырежды промойте его буфером PSS. После последнего промывания снова заполните камеру раствором PSS и подождите три минуты, после чего снова заполните камеру PSS и вызовите сокращение с помощью PE. Как было показано ранее, теперь артерия готова к эксперименту.

Измерьте релаксацию сокращенных сосудов путем кумулятивного добавления возрастающих концентраций хлорида кальция. В этой таблице показано, что базальное напряжение после применения фенилэфрина различалось у крыс Wistar, DS (солечувствительных по Доллу) и DR (солерезистентных по Доллу). Данная кривая для крысы Wistar демонстрирует релаксацию сокращенных PE артерий при кумулятивном добавлении кальция; в тканях крыс DS релаксация была серьезно нарушена по сравнению с крысами Wistar и крысами DR. Как видно здесь, различия в чувствительности к кальцию проявляются в кривых кальциевого ответа, а также при расчете значений EC 50.

Наконец, у крыс линии DS наблюдается снижение экспрессии кальций-чувствительного рецептора в артериях по сравнению с крысами линии Dr.Rats. После освоения данной методики ее выполнение при правильном подходе может занять два часа. Посмотрев это видео, вы должны получить четкое представление о том, как сравнивать сосудистую реактивность мелких энтериальных артерий на экзогенные соединения в изометрических условиях.