Name: Espansione del sangue periferico umano γδ cellule T con Zoledronato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Scopri l'espansione su larga scala di cellule T γδ dal sangue periferico umano utilizzando zoledronato e IL-2. Questo metodo supporta l'immunoterapia cellulare autologa nel trattamento del cancro.

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1. Isolamento dei PBMC <ol><li> Prelievo di sangue (7,5-8,0 ml) in una provetta BD Preparazione Vacutainer cella CPT con eparina di sodio. Il tubo contiene un anticoagulante eparina sodica e di un Ficoll-Hypaque densità del fluido, più una barriera di gel di poliestere, che separa i due liquidi. Centrifuga tubo / campione di sangue a temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) in un rotore orizzontale (swing-out testa) per 20 minuti a 1800 x g. Interruttore centrifuga freni sbloccati. </li><li> Dopo la centrifugazione, la sequenza di strati avviene nel seguente modo (visto dall'alto verso il basso): a) al plasma - b) le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e piastrine - c) soluzione di densità - d) gel poliestere - e) granulociti - f) globuli rossi (Fig. 1). </li><li> Raccolgono una frazione dello strato di plasma, lasciando 5 a 10 mm di plasma al di sopra della interfase senza disturbare lo strato di cellule. Il plasma può essere utilizzato per la cultura (sezione 2.5). </li><li> Raccolta della frazione arricchita (PBMC) presso l'interfase con una pipetta e trasferirli in un tubo da 15 ml. </li><li> Lavare i PBMC con 10 ml di soluzione salina tampone fosfato (PBS), invertendo il tubo di 5 volte, quindi si centrifuga per 5 min a 400 x g. </li><li> Ripetere le fasi di lavaggio due volte, quindi risospendere il pellet cellulare in 5 ml di PBS. Determinare il numero delle cellule. Di solito 1,3 x10 6 celle vengono recuperati da 1 ml di sangue intero. </li><li> Determinare la frequenza e il fenotipo delle cellule T in γδ PBMC mediante citometria di flusso (sezione 3) (Fig. 2). </li></ol> 2. Espansione di cellule T γδ <ol><li> Centrifuga sospensioni cellulari in provette da 15 ml conica per 5 min a 400 x g a temperatura ambiente, ed eliminare il surnatante. </li><li> Preparare terreno di coltura (CM) con l'aggiunta di IL-2 (IL-2) e zoledronato (Zometa) a concentrazioni finali di 1000 UI / ml e 5 mM, rispettivamente. ALyS203 (Cell Science &amp; Technology Institute) o OpTmizer (Invitrogen) supportare l'espansione dei media buona γδ cellule T (maggiori informazioni nei riferimenti 6 e 9). Zometa è fornito in forma liquida (4 fiala mg/5-ml). Per preparare una soluzione al 5 mM, aggiungere 50 ml di Zometa a 30 ml di terreno di coltura. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in terreno di coltura e regolare a 1x10 6 cellule / ml. </li><li> Pipettare 1 ml di CM contenente 1x10 6 cellule in ciascun pozzetto di una 24-pozzetti. Per le grandi culture, le cellule possono essere seminati a 0,5 x 10 6 cellule / cm 2 secondo le superfici dei pozzi piatto, piatto, o borraccia. </li><li> Aggiungi plasma autologo (sezione 1.3), pool umano AB sieri, o FCS in modo che sia circa il 10% del volume della cultura (100 microlitri per ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti). Posizionare le piastre in un umidificata 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 24-48 ore. </li><li> Mantenere la coltura ad una densità cellulare di 0,5-2 x 10 6 cellule / ml. Aggiungi terreno fresco contenente umano IL-2 (1000 UI / ml) (senza Zometa) ogni 2-3 giorni, e trasferire cellule coltivate in nuovi pozzi o fiaschi, se necessario, a seconda del grado di proliferazione cellulare (Fig. 3). Fornitura plasma o siero al mezzo in modo che la concentrazione sierica può essere mantenuto almeno l'1%. </li><li> Celle di raccolta il giorno 12-14 e determinare la, fenotipo frequenza, e le funzioni del γδ cellule T mediante citometria di flusso (vedi sotto). </li></ol> 3. L'analisi fenotipica mediante citometria di flusso <ol><li> Trasferire 200 campioni microlitri contenente 2 x 10 5 cellule a fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) tubi. </li><li> Aggiungere 2 ml di PBS freddo e centrifugare per 5 min a 400 x gr. Poi, risospendere il pellet in 50 microlitri di buffer FACS (PBS + 1% di sodio azide FCS + 0,1%). Aggiungere 5 ml di ciascuna anticorpi ai campioni (gli anticorpi monoclonali sono elencati nella Tabella 1). </li><li> Incubare in ghiaccio al buio per 20 min. </li><li> Aggiungere 2 ml di tampone FACS per ogni campione, e poi vortice. Campioni Centrifugare per 5 min a 400 x g a 4 ° C. Con attenzione decantare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 300 microlitri di buffer FACS e vortice. Analizzare campioni su un citofluorimetro (Fig. 2). </li></ol> 4. IFN-γ saggio produzione 10 <ol><li> Il giorno prima del test, preparare le cellule stimolatore di coltura 3-5 x10 Daudi 5 cellule / ml in RPMI 1640 medium più 10% FCS (RPMI-10) durante la notte con Zometa (5 mM) (nel seguito denominati Z-Daudi). </li><li> Raccogliere Z-Daudi e risospendere in RPMI-10 a 2x10 6 cellule / ml. Aggiungere 100 ml di Z-Daudi (2x10 5) a ciascun pozzetto di una piastra a fondo rotondo da 96 pozzetti. </li><li> Preparare γδ cellule T a 2x10 6 cellule / ml in RPMI-10 contenente Brefeldin A a 20 mg / ml. Trasferire 100 ml di γδ sospensione cellulare T (2x10 5) in ciascun pozzetto contenente Z-Daudi cellule o di pozzetti di controllo (100 ml di RPMI-10 solo, o RPMI-10 con 20 ng / ml di forbolo miristato 12-13-acetato[PMA] e 2 mg / ml di ionomicina). </li><li> Mescolare pipettando su e giù parecchie volte. Incubare per 4 ore a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Centrifugare la piastra per 5 minuti a 400 x g a 4 ° C e risospendere il pellet in 200 ml di PBS freddo. </li><li> Trasferire i campioni di tubi FACS. Aggiungere 4 ml di PBS freddo e centrifugare le provette per 5 min a 400 x g a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet in 50 ml di buffer di FACS con FITC-coniugato anti-TCRVγ9 (5 mL) e PE/Cy5-conjugated anti-CD3 (2,5 microlitri). Incubare al riparo dalla luce per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 100 ml di reagente IntraPrep 1 e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 4 ml di PBS in ogni provetta e centrifugare per 5 min a 400 x g a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare il surnatante tramite aspirazione e aggiungere 100 ml di reagente 2 IntraPrep. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. </li><li> Aggiungere 5 ml di PE-coniugato anti-IFN-γ mAb alla provetta. Incubare al riparo dalla luce per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 4 ml di PBS in ogni provetta e centrifugare per 5 min a 400 x g a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante tramite aspirazione e risospendere il pellet cellulare in 0,5 ml di tampone FACS. </li><li> Analizzare le cellule citofluorimetro. Porta il CD3 + + TCRVγ9 cellule ed esaminare l'espressione di IFN-γ (Fig. 4). </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: E 'importante per determinare la percentuale di cellule T nel γδ PBMC all'inizio della cultura. Come mostrato in fig. 2 A, la percentuale dei CD3 + + TCRVγ9 γδ cellule T in PBMC è stata di 1,6% al giorno 0. Le popolazioni dominanti erano CD45RA + CD27 + CD27 + ingenuo o CD45RA - fenotipi memoria centrale. Quando γδ cellule T sono stati stimolati in modo efficiente, hanno formato grappoli nei giorni 3-5 (Fig. 3 A e B). Quando la formazione di cluster è stato ritardato, la crescita di altri tipi cellulari, quali CD4 + e CD8 + cellule T αβ o cellule NK potrebbe dominare la crescita di γδ cellule T (fig. 3 C e D). Dopo 14 giorni di cultura, la frequenza di cellule T γδ aumentato a oltre il 93,8% delle cellule coltivate in successo culture γδ cellule T (Fig. 2 E). Le colture di cellule T γδ upregulated NKG2D e CD69 espressione (fig. 2 G e H). Hanno mostrato CD27 - CD45RA - fenotipo memoria effettore (Fig. 2 F). Le funzioni di γδ cellule T sono stati valutati per quanto riguarda la produzione di citochine e citotossicità. L'IFN-γ intracellulare colorazione γδ dimostrato che le cellule T prodotte IFN-γ in risposta alla PMA / ionomicina trattamento o Z-Daudi cellule che IPP accumulato dopo il trattamento con zoledronato (Fig. 4). Questi risultati indicano che zoledronato può efficacemente stimolare e ampliare funzionale delle cellule T γδ. <table border="1"><tbody><tr><td> tubo </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> ECD </td><td> PE/Cy5 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> CD3 </td><td> CD19 </td><td> CD45 </td><td> CD14 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> CD3 </td><td> TCRαβ </td><td> CD4 </td><td> CD8 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> CD3 </td><td></td><td></td><td> CD56 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> TCRαβ </td><td> CD45 </td><td> CD3 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> NKG2D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> CD69 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> del mouse IgG1 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> CD45RA </td><td> CD27 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> del mouse IgG1 </td><td> del mouse IgG1 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Anticorpi monoclonali utilizzati in colorazione multicolore delle cellule T γδ. Un esempio di analisi fenotipica di cellule T γδ eseguiti nel nostro laboratorio è mostrato in fig. 2. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Separazione dei PBMC. Sangue (7,5-8,0 ml) è disegnato in un tubo BD Preparazione Vacutainer cella CPT con eparina di sodio e direttamente centrifugati per 20 min a 1800 x g. Dopo la centrifugazione, gli strati risultante come si è visto da cima a bottom: a) al plasma - b) PBMC e piastrine - c) soluzione di densità - d) gel poliestere - e) Granulociti - f) i globuli rossi. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fenotipo superficie tipica delle cellule T γδ. PBMC sono stati stimolati con zoledronato e IL-2 per 14 giorni. Le cellule sono state colorate con FITC anti-TCR Vγ9 e PE/Cy5-labeled anti-CD3 di monitorare l'espansione della γδ cellule T (A ed E). γδ cellule T sono stati identificati dalla loro espressione di TCRVγ9, e la loro espressione di CD27 e CD45RA (B e F), NKG2D (C e G), o CD69 (D e H) è stata esaminata. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Rappresentante γδ colture di cellule T. PBMC sono stati stimolati con IL-2 (1000 UI / ml) e zoledronato (5 mM). Campi rappresentativi sono visibili (IX71 microscopio invertito [Olympus] x 200). Cluster e aggregati di cellule T γδ può essere osservato il giorno 3 (A) e il giorno 5 (B), quando γδ cellule T sono state espanse con successo. Al contrario, nessun cluster o aggregati sono stati osservati quando γδ crescita delle cellule T non era adeguata (C e D). <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. IFN-γ produzione. γδ cellule T sono state incubate con RPMI-10 solo (A) o PMA / ionomicina (B) o Z-Daudi (C) per 4 ore. In primo luogo, espressione di superficie di TCRVγ9 era macchiato e poi IFN-γ produzione è stata esaminata dal intracellulare IFN-γ colorazione. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Cinetica di γδ colture cellulari T. (A) il numero assoluto di cellule in coltura, (B) percentuale di γδ cellule T, e (C) numero assoluto di γδ cellule T nei punti di tempo indicato.

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<li>Abe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunological+evaluation+of+zoledronate-activated+V%CE%B39+%CE%B3%CE%B4T-cell-based+immunotherapy+for+patients+with+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma.</a> Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).</li>
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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo presentato qui permette l&#39;espansione delle cellule T efficiente γδ da PBMC. γδ cellule T attivate e ampliato da zoledronato e IL-2 sviluppano completa funzioni effettrici, riflessa dalla produzione di citochine e citotossicità. E &#39;stato riportato che il sintetico phosphoantigens pirofosfato bromohydrin (BrHPP) e 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP) anche espandere le cellule T γδ, tuttavia, non sono disponibili in commercio. Al contrario, zoledronato è già concesso in licenza per le applicazioni c...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente nome </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> ZOMETA </td><td> Novartis Pharma K. K </td><td></td><td> zoledronato </td></tr><tr><td> Proleukin </td><td> Novartis Pharmaceuticals </td><td></td><td> umano ricombinante IL-2 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer CPT Preparazione del tubo cellulare con sodio eparina </td><td> BD </td><td> 362753 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870-076 </td><td></td></tr><tr><td> ALyS203-media </td><td> Cellula Science &amp; Technology Institute </td><td> 0301-7 </td><td></td></tr><tr><td> OpTmizer </td><td> Invitrogen </td><td> 0080022SA </td><td></td></tr><tr><td> Un brefeldin </td><td> Sigma </td><td> B5936-200UL </td><td></td></tr><tr><td> forbolo miristato 12-13-acetato (PMA) </td><td> Sigma </td><td> P1585-1MG </td><td></td></tr><tr><td> ionomicina </td><td> Sigma </td><td> 13909-1 ml </td><td></td></tr><tr><td> IntraPrep </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07803 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umano-CD3 FITC o PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07746 FITC A07749 PE/Cy5 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umano CD4-ECD </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6604727 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umana CD8-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6607011 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umana CD14-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07765 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umano CD19-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07769 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umano CD45-ECD </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07784 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umana CD56-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07789 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umano TCRαβ-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A39499 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umano TCR Vγ9-FITC </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM1463 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umana CD27-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6607107 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umano CD45RA-ECD </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM2711 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umano CD69-PE </td><td> BD </td><td> 555531 </td><td></td></tr><tr><td> anti-umano NKG2D-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A08934 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humal IFNγ-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM2717U </td><td></td></tr><tr><td> IgG1 isotipo di controllo-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07796 </td><td></td></tr><tr><td> IgG1 isotipo di controllo-ECD o PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07797 A07798 </td><td></td></tr></tbody></table>

espansione del sangue periferico umano γδ cellule t con zoledronato

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Γδ cellule T in grado di riconoscere e rispondere a una vasta gamma di antigeni indotta da stress, sviluppando in tal modo innato attività ampio anti-tumorale e anti-infettivi. 1 La maggior parte dei γδ cellule T nel sangue periferico hanno il recettore delle cellule T Vγ9Vδ2. Queste cellule riconoscono l&#39;antigene in un complesso maggiore di istocompatibilità modalità indipendente e sviluppare una forte funzioni citolitica e Th1-come effettore. 1 Perciò, γδ cellule T sono cellule effettrici candidato attraente per l&#39;immunoterapia del cancro. Vγ9Vδ2 cellule T rispondere a phosphoantigens come (E)-4-idrossi-3-metil-but-2-enil pirofosfato (HMBPP), che è sintetizzata nei batteri attraverso isoprenoidi biosintesi, 2 e isopentenil pirofosfato (IPP), che viene prodotto nelle cellule eucariotiche attraverso la via mevalonato. 3 In condizioni fisiologiche, la generazione di IPP ​​nella cella nontransformed non è sufficiente per l&#39;attivazione delle cellule T γδ. Disregolazione della via mevalonato nelle cellule tumorali porta all&#39;accumulo di IPP ​​e l&#39;attivazione delle cellule T γδ. 3 Poiché aminobifosfonati (come pamidronato o zoledronato) inibiscono la farnesil pirofosfato sintasi (FPP), l&#39;enzima agisce a valle di IPP ​​nella via mevalonato, i livelli intracellulari di IPP e sensitibity γδ per il riconoscimento delle cellule T possono essere terapeuticamente aumentato di aminobifosfonati. IPP accumulo è meno efficiente in cellule nontransfomred rispetto alle cellule tumorali con una concentrazione farmacologicamente rilevanti aminobifosfonati, che ci permettono l&#39;immunoterapia per il cancro attivando γδ cellule T con aminobifosfonati 4. Interessante, IPP si accumula nei monociti quando PBMC sono trattati con aminobifosfonati, a causa di efficienti assunzione di droghe da queste cellule 5. monociti che si accumulano IPP diventare cellule presentanti l&#39;antigene e stimolare Vγ9Vδ2 cellule T nel sangue periferico. 6 Sulla base di questi meccanismi, abbiamo sviluppato una tecnica per la grande espansione del γδ colture di cellule T con zoledronato e interleuchina -2 (IL-2). 7 Altri metodi per l&#39;espansione delle cellule T γδ utilizzare il sintetico pirofosfato bromohydrin phosphoantigens (BrHPP) 8 o 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP) 9. Tutti questi metodi consentono ex vivo di espansione, con conseguente gran numero di γδ cellule T per l&#39;uso in immunoterapia adottiva. Tuttavia, solo zoledronato è un reagente approvato dalla FDA disponibili in commercio. Zoledronato espanso γδ cellule T CD27 schermo - CD45RA - fenotipo effettore memoria e la loro funzione può essere valutata da IFN-γ test di produzione 7.

Un metodo per espandere γδ cellule T dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) è descritta. PBMC cellule derivate γδ T vengono stimolati e ampliati con zoledronato e interleuchina-2 (IL-2). L&#39;espansione su larga scala di γδ cellule T possono essere applicate a autologo immunoterapia cellulare del cancro.

Espansione del sangue periferico umano γδ cellule T con Zoledronato

Le cellule T $\gamma\delta$ umane possono riconoscere e rispondere a un'ampia varietà di antigeni indotti dallo stress, sviluppando così una risposta antitumorale innata e ampia e...

In questo video viene illustrata l'espansione su larga scala di cellule T gamma delta del sangue periferico umano mediante l'uso di zoledronato. Inizialmente, il sangue intero viene sottoposto a centrifugazione su gradiente di densità per isolare le cellule mononucleate del sangue periferico, o PBMC. Le PBMC vengono stimolate con zoledronato per indurre la trasformazione dei monociti in cellule presentanti l'antigene e contemporaneamente con IL-2 per attivare le cellule T gamma delta.Le cellule vengono incubate fino a 14 giorni al fine di favorire la proliferazione delle cellule T gamma delta. L'analisi della coltura mediante citometria a flusso dimostra che la maggior parte delle cellule raccolte presenta un fenotipo CD3 positivo e Vγ9 positivo. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che il farmaco è già autorizzato per applicazioni cliniche con Zometa.Pertanto, un reagente affidabile è facilmente disponibile per la preparazione clinica di cellule T gamma delta, dimostrando che la procedura sarà di coltura cellulare makoto condo e amichi izumi. I tecnici del mio laboratorio iniziano questa procedura isolando le cellule mononucleate del sangue periferico dal sangue intero raccolto in un tubo BD vacutainer CPT per la preparazione cellulare contenente eparina sodica come anticoagulante e un liquido ad alta densità fial, oltre a una barriera in gel di poliestere, che separa i due liquidi. Centrifugare il campione a temperatura ambiente in un rotore orizzontale a cestello oscillante per 20 minuti a 1800 volte G. Dopo la centrifugazione, il contenuto del tubo si separerà in cinque strati.Lo strato superiore giallo chiaro è costituito dal plasma. Al di sotto, uno strato biancastro contiene le cellule mononucleate del sangue periferico e le piastrine, che si trovano al di sopra della soluzione densitaria giallo chiaro. Uno strato di gel di poliestere di colore bianco separa questo dagli strati granulari, che formano uno strato grigiastro posizionato al di sopra dei globuli rossi nella parte inferiore del tubo.Utilizzando una pipetta da due millilitri, raccogliere con attenzione una frazione dello strato di plasma, lasciando da cinque a dieci millimetri di plasma sopra l'interfaccia, e trasferirla in un tubo conico da 15 millilitri. Posizionare il tubo a quattro gradi Celsius per l'utilizzo in coltura. Successivamente, utilizzare una pipetta da due millilitri per raccogliere la frazione arricchita in PBMC presente all'interfaccia e trasferirla in un tubo conico da 15 millilitri.Per lavare i PBMC, aggiungere 10 millilitri di PBS e capovolgere il tubo cinque volte. Quindi centrifugare il tubo per cinque minuti a 400 ×g. Ripetere i passaggi di lavaggio due volte. Successivamente, dopo aver risospeso il pellet cellulare in cinque millilitri di PBS, utilizzare un emocitometro per determinare il numero di cellule.Tipicamente, vengono recuperate 1,3 × 10⁶ cellule da un millilitro di sangue intero. Una frazione di PBMC contenente 1 × 10⁶ cellule viene separata e mantenuta sul ghiaccio per l'analisi mediante citometria a flusso.Per espandere le cellule T gamma delta nel campione di PBMC, centrifugare le sospensioni cellulari in provette coniche da 15 millilitri per cinque minuti a 400 ×g a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, eliminare i soprannatanti e risospendere le cellule in mezzo di coltura cellulare, integrato con 1000 UI/mL di IL-2 e 5 micromoli di zoledronato, a una densità di 1 × 10⁶ cellule per millilitro. Lo zoledronato inibisce la fosfato sintetasi della fosfato di farneysil nei monociti, portando all’accumulo di pirofosfato di isopentenile e alla trasformazione dei monociti in cellule presentatrici di antigene.Successivamente, pipettare un millilitro di mezzo contenente un milione di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Le cellule dovrebbero essere a 0,5 milioni per centimetro quadrato. Pertanto, per colture più grandi, scalare in modo proporzionale per ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.Aggiungere 100 microlitri di plasma autologo raccolto in precedenza, siero umano AB in pool o FBS. Posizionare le piastre in un'atmosfera umidificata a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica ogni due o tre giorni. Sostituire il mezzo con un mezzo fresco integrato con siero contenente 1000 UI per millilitro di IL-2 umana.Quando le cellule raggiungono una densità compresa tra 0,5 e 2 × 10⁶ cellule per millilitro, suddividerle in rapporto 1:2 in nuove pozzette o fiaschi. Osservare le cellule nel corso di diversi giorni. Qui vengono mostrate le cellule al giorno zero.Le cellule più piccole sono linfociti. Le cellule più grandi sono monociti. Circa 24 ore dopo, i monociti aderiscono al fondo della pozzetta.Dopo due giorni, alcuni linfociti si attaccano ai monociti entro il terzo giorno, le cellule T gamma delta iniziano a formare aggregati. Entro il quinto giorno, è possibile osservare grandi aggregati cellulari. Al contrario, nessun aggregato o raggruppamento sarà visibile quando la crescita delle cellule T gamma delta non è adeguata. Quando la formazione di aggregati è ritardata.Come mostrato qui, la crescita di altri tipi cellulari, come le cellule T alfa beta CD4 positivo o CD8 positivo o le cellule NK, domina la crescita delle cellule T gamma delta. Al giorno 12-14, pipettare accuratamente le cellule con una pipetta da 10 millilitri e raccogliere le cellule in provette coniche da 50 millilitri. Le cellule possono ora essere analizzate mediante citometria a flusso per determinare la frequenza, il fenotipo e le funzioni delle cellule T gamma delta.Per eseguire l'analisi fenotipica di PBMC o di cellule T gamma delta espanse, iniziare trasferendo campioni di 200 microlitri contenenti due volte 10 alla quinta cellule in ciascuna delle nove provette per la citofluorimetria a flusso. Aggiungere due millilitri di PBS freddo e centrifugare per cinque minuti a 400 × g, quindi risospendere i pellet in 50 microlitri. Aggiungere cinque microlitri di ciascuno degli anticorpi necessari ai campioni.Incubare i campioni sul ghiaccio al buio per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere due millilitri di buffer fax a ciascun campione, quindi vortexare e centrifugare i campioni per cinque minuti a 400 ×g a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, decantare con attenzione il soprannatante, risospendere le cellule in 300 microlitri di buffer fax e vortexare.Quindi analizzare i campioni mediante citometria a flusso per valutare la funzione delle cellule T gamma delta. La loro capacità di produrre interferone gamma viene analizzata mediante colorazione intracellulare per l'interferone gamma. Sospendere le cellule T gamma delta a due volte 10 alla sesta cellule per millilitro in RPMI 10 contenente felden A a 20 microgrammi per millilitro.Felden A inibisce la secrezione di interferone gamma, provocando l'accumulo di interferone gamma all'interno della cellula. Successivamente, trasferire 100 microlitri di sospensione di cellule T gamma delta in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contenente 100 microlitri di RPMI 10 soltanto, oppure RPMI 10 con 20 nanogrammi per millilitro di four. Ball 12 ate 13 acetate più 2 microgrammi per millilitro di ionomicina o cellule Z duddy.Mescolare aspirando e dispensando più volte con una pipetta. Incubare per quattro ore in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Quindi centrifugare la piastra per cinque minuti a 400 ×g a quattro gradi Celsius dopo la risospensione, risospendendo i pellet in 200 microlitri di PBS freddo.Trasferire i campioni in provette fax. Quindi aggiungere quattro millilitri di PBS freddo e centrifugare le provette per cinque minuti a 400 ×g a quattro gradi Celsius; dopo la centrifugazione, risospendere i pellet in 50 microlitri di buffer fax con cinque microlitri.Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, con 2,5 microlitri di anticorpo monoclonale anti TCRV gamma nove coniugato con FE e 2,5 microlitri di anticorpo monoclonale anti CD3 coniugato con PE SCI cinque. Al termine dell'incubazione, aggiungere 100 microlitri del reagente intra prep uno e incubare per 15 minuti. A temperatura ambiente, aggiungere quattro millilitri di PBS in ogni provetta e centrifugare per cinque minuti a 400 ×g a temperatura ambiente; dopo la centrifugazione, risospendere il pellet in 100 microlitri del reagente intra prep due e incubare per cinque minuti.A temperatura ambiente, aggiungere cinque microlitri di anticorpo monoclonale anti-interferone gamma coniugato con PE nel tubo da saggio. Incubare al buio per 15 minuti. A temperatura ambiente, aggiungere quattro millilitri di PBS in ciascun tubo e centrifugare per cinque minuti a 400 ×g. A temperatura ambiente, rimuovere il soprannatante mediante aspirazione e risospendere il pellet cellulare.In 0,5 millilitri di buffer fax. Analizzare le cellule mediante citometria a flusso, impostando il gate sulle cellule CD3 positive e TCR v gamma 9 positive, ed esaminare l'espressione dell'interferone gamma. Il tipico fenotipo di superficie delle cellule T gamma delta è qui mostrato.I linfociti T gamma delta sono stati identificati in base alla loro espressione di CD3 e TCRVγ9 al giorno zero. La percentuale di linfociti T gamma delta positivi per CD3 e positivi per TCRVγ9 nei PBMC era del 1,6%. Le popolazioni predominanti di linfociti T gamma delta erano CD27 positivi, CD45RA positivi con fenotipo naïve, oppure CD27 positivi, CD45RA negativi con fenotipo di memoria centrale. L'espressione di CD27 e CD45RA viene utilizzata per determinare il loro fenotipo naïve o di memoria.CD27 positivo. CD45. RA positivo è naive.CD27 positivo. CD45RA negativo è memoria centrale CD27 negativo. CD45.RA negativo è memoria effettrice. CD27 negativo. CD45.RA positivo è un fenotipo differenziato in modo terminale. Lo stato di attivazione delle cellule è stato analizzato mediante NK G 2D o CD 69, come mostrato qui. Le cellule T gamma delta esprimono NK G 2D, ma non esprimono CD 69.Dopo 14 giorni di coltura, la frequenza delle cellule T gamma delta è aumentata a più del 93,8% delle cellule coltivate. Nelle colture di cellule T gamma delta di successo, queste mostravano un fenotipo di memoria effettore CD27 negativo e CD45RA negativo. Le cellule T gamma delta coltivate hanno aumentato l'espressione di NKG2D e CD69.La colorazione intracellulare per l'interferone gamma ha dimostrato che le cellule T gamma delta producevano interferone gamma in risposta al trattamento con PMA CIN o alle cellule Z dwy che accumulavano IPP. Dopo il trattamento con zoledronato, il 97% e il 19,6% delle cellule T gamma delta producevano interferone gamma in risposta rispettivamente alla stimolazione con PMA CIN e con cellule Z ddy. Questi risultati indicano che lo zoledronato può stimolare ed espandere in modo efficiente cellule T gamma delta funzionali.La cinetica della coltura di cellule T gamma delta espansa mediante zoledronato e IL-2 mostra un aumento esponenziale del numero assoluto di cellule coltivate fino a 12-14 giorni. L'arricchimento delle cellule T gamma delta è stato ottenuto relativamente precocemente. Già al giorno 7, circa l'80% delle cellule coltivate erano cellule T gamma delta. Il numero assoluto di cellule T gamma delta nei diversi punti temporali indicati dimostra che possono essere ottenute circa 2,2 × 10⁸ cellule T gamma delta a partire da 1 × 10⁶ cellule mononucleate del sangue periferico (PPMC) contenenti 1,6 × 10⁴ cellule T gamma delta dopo il loro sviluppo.Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dell'immunoterapia anticancro per esplorare applicazioni cliniche in molti tipi diversi di cancro. Questo metodo di coltura è stato utilizzato in studi clinici di fase uno, valutando la sicurezza e la fattibilità della terapia mediante trasferimento di linfociti T gamma delta espansi da donatore in pazienti con cancro.

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