Reinigung von Hsp104, ein Protein Disaggregase

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, große Mengen an hochaktivem HSP 1 0 4 A Protein Deaggregation herzustellen. Dies wird erreicht, indem HSP 1 0 4 zunächst im Code auf optimierten E-Coli-Zellen exprimiert wird. Das HS P 1 0 4-Protein wird dann mit Hilfe eines Histidin-Affinitäts-Tags aufgereinigt, gefolgt von einer Ionenaustauschersäule.

Nach der Ionenaustauschchromatographie. Der Histidin-Tag wird mit einer TEV-Protease gespalten. Der letzte Reinigungsschritt besteht darin, das gespaltene HSP 1 0 4-Protein durch eine Gelfiltrationssäule laufen zu lassen.

Letztendlich wird auch der Elif-Reaktivierungsassay verwendet, um festzustellen, ob aktives HSP 1 0 4 gereinigt wurde. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Protokollen besteht darin, dass sowohl eine kleine Anzahl von Schritten in der großen Ausbeute an hochaktivem HSP 1 0 4 für strukturelle als auch für mechanistische Studien geeignet ist. Personen, die neu in dieser Methode sind, können Schwierigkeiten haben, da die meisten Reinigungsschritte an einem einzigen Tag stattfinden, was zu einem anspruchsvollen Zeitplan führt.

Bevor Sie mit diesem Protokoll beginnen, bereiten Sie alle notwendigen Puffer für die Aufreinigung von HSP 1, 0, 4 vor, wie in dem schriftlichen Protokoll beschrieben, das diesem Video beigefügt ist. Exprimieren Sie auch das HSP 1 0 4 Protein über Nacht in E. coli nach dem im Text nach der Expression beschriebenen Verfahren, ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation. Suspendieren Sie die Zellpellets vor der Zelllyse in 10 Millilitern vorgekühltem Lysepuffer mit einem French-Press-Homogenisator und stellen Sie sicher, dass alle Zellklumpen solubilisiert wurden. Nach dem Äquilibrieren lyriert der Homogenisator mit dem Lysepuffer die Zellen mit zwei Durchgängen durch den Zylinder.

Bei einem Druck von 15.000 bis 18.000 PS entferne ich die Zelltrümmer durch Zentrifugation und behalte den Überstand für die weitere Reinigung. Beginnen Sie die Reinigung von HSP 1 0 4, indem Sie den Überstand mit einer 50%igen Aufschlämmung von Lysepuffer mit Nickel-SRO-Drehzahlen mischen. Drehen Sie die Probe drei Stunden lang langsam bei vier Grad Celsius, so dass die Kügelchen gleichmäßig schweben und das Aufschäumen minimiert wird.

Nach der Inkubation werden die Nickel-Sphäros durch Zentrifugation gesammelt. Waschen Sie die zurückgewonnenen Nickel-Spheros mit 25 Säulenvolumenteilen Waschpuffer. Sammeln Sie die Kügelchen erneut durch Zentrifugation, wonach der Waschpuffer durch Aspiration entfernt werden kann.

Waschen Sie dann die Kügelchen mit fünf Säulenvolumina Waschpuffer mit einem molaren Kaliumchlorid, gefolgt von 25 Säulenvolumina Waschpuffer. Zur Eluierung von HSP 1 0 4. Mischen Sie die Nickel-Sphero-Geschwindigkeiten mit Elutionspuffer und drehen Sie sie 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Trennen Sie die Kügelchen vom Eluat durch Zentrifugation durch leere 1,2 Milliliter. Spalten drehen. Jeder Liter Zellen ergibt etwa 15 Milligramm HSB 1 0 4.

Zu diesem Zeitpunkt der Reinigung konzentrieren Sie das Eluat auf etwa 1,5 Milliliter unter Verwendung eines Molekulargewichtsgrenzwerts von 30,015 Millilitern. Zentrifugalkonzentrator-Einheiten. Fügen Sie dann 14,5 Milliliter Puffer Q hinzu, um das Protein zu verzehnfachen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal, um zu puffern. Tauschen Sie das Protein vor der Aufreinigung von HSP 1 0 4 mittels Anionenaustauschchromatographie aus. Filtern Sie das Protein durch einen 0,22-Mikromolar-Spritzenvorsatzfilter mit geringer Proteinbindung.

Injizieren Sie dann das Protein auf eine Puffer-Q-äquilibrierte Ressource Q von sechs Millilitern. Wöchentliches Wegspülen von Bindungsproteinen mit einem Säulenvolumen von 20 %Puffer B eluiert das HSB 1 0 4 mit einem linearen Gradienten über fünf Säulenvolumina und sammelt Ein-Milliliter-Fraktionen, HSB 1 0 4 und die meisten Varianten eluieren typischerweise bei etwa 400 millimolarem Natriumchlorid. Um den Hexa-Histidin-Tag zu entfernen, tauschen Sie das Protein mit einem Zentrifugalkonzentrator aus und klemmen Sie den Tag mit der TEV-Protease gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Zwei bis vier Stunden lang bei 30 Grad Celsius gespalten, gefolgt von einer 16-stündigen Inkubation bei vier Grad Celsius. Verbleibendes Hexahistidin, markiertes HSB 1 0 4 und TEV-Protease mit Nickel-SROs abbauen, indem die überschüssigen Kügelchen in der Spaltreaktion in die Menge von HSP 1 0 4 versetzt werden. Anschließend werden die Kügelchen durch Zentrifugation durch leere Spin-Säulen aus der Probe entfernt.

Zur Vorbereitung des letzten Reinigungsschritts wird das Protein unter Verwendung des Molekulargewichts-Cutoffs in einen Größenausschlusspuffer umgetauscht. 30.000 Zentrifugalfiltereinheiten nach der Filtration durch einen 0,22-Mikromolar-Spritzenvorsatzfilter mit geringer Proteinbindung. Weitere Aufreinigung von HSP 1 0 4 mittels Größenausschlusschromatographie unter Verwendung eines Größenausschlusspuffers.

ÄQUILIBRIERT super oh sechs Spalten. Führen Sie den FPLC-Lauf gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Nach der Reinigung ziehen Sie die HSP 1 0 4-Fraktionen und konzentrieren Sie sie in Zentrifugalkonzentratoreinheiten. Aufgrund des Materialverlusts bei der Trennung von HSP 1 0 4-Abbauprodukten und Kontaminanten beträgt die Endausbeute an gereinigtem HSP 1 0 4 in voller Länge etwa ein bis drei Milligramm pro Liter Ausgangskultur.

Hier ist die SDS-Seitenanalyse der Nickel-Seros-Affinitätsreinigung zu sehen. Das mit Histidin markierte 105 Kilodalton HSP 1 0 4 Protein ist in Proben sichtbar, die aus dem Lysat, der Bead-Ladung, dem Bead-Flow-Through und dem Bead eit entnommen wurden. Es ist zu beachten, dass nicht alle HSP 1, 0, 4 in der Lage sind, an die Nickel-Spheros zu binden. Auf die Nickel-Affinitätschromatographie folgt ein Ionenaustausch an einer Ressourcenwarteschlangensäule

Die blaue Spur stellt die Absorption bei 280 Nanometern dar und die grüne Spur stellt den prozentualen Puffer B dar. Der erste Peak, der bei 20 % B austritt, enthält Verunreinigungen, Abbauprodukte und falsch gefaltetes HSP 1 0 4. Der und major Peak enthält korrekt gefaltetes und aktives HSP 1 0 4, wie die SDS-Seitenanalyse nach dem Ionenaustausch zeigt. Das HEXA Histamin HSP 1 0 4 Protein unterliegt der Spaltung des Hiss-Tags durch pro TV Protease-Spaltung.

Es ist zu beachten, dass prot v gespaltenes HSP 1 0 4 schneller migriert als das Hexahistidin und das markierte Protein. Das gespaltene HSP 1 0 4 wurde dann über eine AUP O Sechs-Gel-Filtrationssäule weiter gereinigt. Die Spitze zwischen den gestrichelten Linien stellt die gepoolten Brüche dar.

Hier sind die Ergebnisse des Luciferase-Reaktivierungsassays dargestellt, der zur Beurteilung der Disaggregationsaktivität von HSP 1 0 4 verwendet wird. Denaturierte Glühwürmchen-Luciferase-Aggregate wurden entweder mit HSP 40 und HSP 72, HSB 1 0 4 oder HSP 1 0 4, HSP 40 und HSB 72 inkubiert. Denaturierte Luziferase wird nur in Gegenwart von HSP 1 0 4 sowie HSP 40 und HSP 72 vollständig reaktiviert, was sich in der starken Zunahme der Lumineszenz nach der Beherrschung zeigt. Dieses Protokoll kann in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn es ordnungsgemäß durchgeführt wird.