RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans

מטרת פרוצדורה זו היא לזהות רגולטורים פוסט-עובריים של ביטוי וחלוקה של חלבונים ב-C elegance באמצעות סריקה גנומית מבוססת RNAi וחלבונים המסומנים בתווית פלואורסצנטית. לאחר בניית זן הסריקה המתאים, נבחרת ספריית RNAi. השלב הראשון של הפרוצדורה הוא אריזת השיבוטים מהספריה לתוך חיידקים.

לאחר מכן נבחרים החיידקים, גודלים ומוזנים לנמטודות *C. elegans* בשלבים התפתחותיים שונים. לאחר המתנה של 72 שעות לצמיחת הנמטודות, הן נבחנות לאיתור שינויים בפנוטיפ הנבדק. לבסוף, שינויים בביטוי או בלוקליזציה התת-תאית של החלבון הנחקר מוצגים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שיטה זו יכולה לזהות גנים הדרושים למיקום תת-תאי תקין של חלבון המסומן במחייב פלואורסצנטי. עם זאת, ניתן לשנות פרוטוקול זה כדי לזהות גנים המשפיעים על פנוטיפים פוסט-עובריים אחרים בעלי עניין. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני פרוטוקולים קיימים שפורסמו הוא שביצענו אופטימיזציה לעקביות ולרמה של תגובת ה-RNAi בבעלי החיים על ידי השראה של ייצור ה-RNA דו-גדילי בחיידקים לפני הזריעה במונח.

את הפרוצדורה תדגים קתי פוס (Kathy fuss), עובדת מחקר מהמעבדה שלי. בתוך חודשיים מתחילת הניסוי, הכינו את ספריית השיבוטים; ראשית, בצעו מריחה של חיידקים משיבוטים נבחרים מספריית ההאכלה, וכן ביקורות חיוביות ושליליות, על מצעי LB עם tetracycline. עבור ביקורת חיובית, השתמשו בשיבוט המכיל גן המייצר פנוטיפ פוסט-עוברי תלוי-מינון, כגון BLE four. עבור ביקורת שלילית, השתמשו בווקטור ריק או בשיבוט המכיל פסאודוגן חזוי ללא פנוטיפים נצפים.

דגרו את הצלחות למשך לילה. עבור כל שיבט, זרעו מושבה בודדת מצלחות הריסוק לתוך שני מיליליטר של מצע LB המכיל 50 micrograms per milliliter של חומצה קרבונילית. דגרו את התרביות למשך לילה עם ניעור. למחרת בבוקר, כאשר התמיסות נראות עכורות, עוררו ייצור של RNA דו-גדילי על ידי הוספת IPTG לתרביות ודגרו אותן למשך ארבע עד חמש שעות נוספות תחת אותם תנאים.

הוספת IPTG מבטיחה השתקה (knockdown) עקבית וחזקה יותר של תוצר הגן המושרית על ידי RNAI, מאשר הסתמכות בלבד על IPTG ועל המעבדה של לוחות ה-NGM. לאחר הדגירה עם IPTG, טפטפו 30 µL תרבית מכל שיבט לתוך כל באער בלוחות NGM RNAi של 24 באערים שהוכנו מראש. שיבט אחד לכל באער. בכל לוח יש להקצות שני באערים לבקרות.

סמנו בזהירות את המיקום של כל ספרייה. לאחר השכפול לפלטות בעלות 24 בארות, הניחו את הפלטות ללא כיסוי בתוך מ !='') תחת מ প্রথমেই זרימה סטרילית לייבוש למשך כ-20 דקות. יש להקפיד שהשוליים של האגר לא ייפרדו מהפלטה.

לאחר שייבשו את הנמטודות במדרגות גיל על הפלטות, ניתנות ההוראות להכנת הנמטודות. בחלק הבא, התחילו עם אוכלוסייה במדרגת גיל של השלב הלרבלי הראשון או נמטודות L1. התחלה עם לרובות L1 עוקפת פנוטיפים פוטנציאליים של תמותה עוברית.

שימוש באוכלוסיית בעלי חיים בשלבים התפתחותיים מדורגים לסריקה מגביר גם את הביטחון בכך שכל השונות שנצפתה נובעת מה-RNAi ולא משינויים נורמליים המתרחשים בשלבים שונים. עם זאת, אם ה-RNAi גורם לעיכוב התפתחותי, הדבר צריך להיות מסומן על ידי הסורק. תמיסה של תאי ביצים (Bleach). אוכלוסייה בשלבים מעורבים של זן הסריקה.

רק עוברים המוגנים על ידי קליפת הביצה ישרדו שלב זה; יש להביא את בעלי החיים לשלבים רלוונטיים בטווח של 12 שעות אם התהליך מבוצע ב-20 °C, או בטווח של 18 שעות אם הוא מבוצע ב-16 °C, ביום שבו מוחדרות תרביות החיידקים. יש לבחור שלוש צלחות של 100 מילימטר של זן הסינון, המכילות בעלי חיים בריאים הכוללים הן בוגרים בהריון והן עוברים.

יש לשטוף את כל בעלי החיים במצע M9 סטרילי ולהעביר את תמיסת השטיפה לתוך מבחנה סטרילית של 15 מיליליטר עם מכסה הברגה. אם נפח השטיפה עולה על 3.5 מיליליטר, יש לצנטריפוג את בעלי החיים ולהסיר את כל הנוזל למעט 3.5 מיליליטר. אם הנפח נמוך מ-3.5 מיליליטר.

הגדילו את הנפח ל-3.5 milliliters באמצעות מים או M nine כדי לשחרר את העובריים מהבוגרים, עם 1.5 milliliters של תערובת sodium hydroxide ומלבין לכל שטיפה. אפשרו לבעלי החיים להדגר בתוך תמיסה זו למשך לא יותר מ-10 דקות. לאחר הפעלת טיימר, בצעו vortex לכל מבחנה למשך 10 שניות וחזרו על ה-vortex מדי שתי דקות.

לאחר כל ערבול (vortexing), יש לבחון את התמיסה תחת מיקרוסקופ דיסקסינג כדי לאתר פגרי בעלי חיים. בתוך שש עד שמונה דקות, הפרטים הבוגרים יתפרקו והעוברים אמורים להשתחרר. הוצא את העוברים מתמיסת התמיסול (bleach) על ידי סבונציה (pelleting) של העוברים והסרת מרב הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע (pellet).

לאחר מכן, השביה מחדש את המשקע בנפח של 10 milliliters על ידי הוספת M nine סטרילי וביצוע ערבוב. חזור על תהליך השטיפה הזה לפחות פעם אחת נוספת עד שריח התכשיר למחיקה אינו ניתן לזיהוי לחלוטין. כדי להגיע לשלב התפתחותי מדויק יותר של בעלי החיים, עכב אותם בשלב L1 על ידי בקיעת העוברים במצע M nine ללא מזון.

פעולה זו מבוצעת על ידי העברת העוברים ב-M nine לבקבוק ארלנמאייר קטן. נערה את הבקבוק למשך הלילה בטמפרטורה המתאימה לזן ולניסוי. במהלך זמן זה, כל בעלי החיים יבקעו ויעצרו בדיאפאוזה של שלב L one למחרת.

הסדירו מחדש את צמיחת הזחלים מנקודת זמן קבועה על ידי העברתם לחיידקים המבטאים RNA דו-גדילי שהוכנו מראש. זהו אותו היום שבו בוצע הפיזור (spotting) של החיידקים על פלטות בעלות 24 בארות. התחילו בהעברת בעלי חיים בשלב L1 למבחנה של 15 מיליליטר וסבבו אותם בצנטריפוגה להשקעה. לאחר מכן, רכזו את בעלי החיים ל-0.5 עד 1 מיליליטר של M9 והניחו 5 מיקרוליטר של נמטודות רכזות על פלטה.

ספרו את מספר בעלי החיים בצלחת והתאימו את תמיסת הנמטודות המרוכזת. TE 30 תולעים לכל שלושה עד 10 µL. לבסוף, טפטפו כ-30 L של בעלי חיים בשלב אחד על הבקטריות בכל באר של המצע שהוכן.

בפלטה בעלת 24 בארות, מספר של יותר מ-30 בעלי חיים לבארה עלול להוביל להרעבה. לאחר שהכתמים התייבשו, דבר שייקח מספר דקות, הדקו את המכסה באמצעות גומייה. דגרו את בעלי החיים במצב הפוך בטמפרטורה ובמשך הזמן הנדרשים כדי להגיע לשלב הרצוי של בעלי החיים. ברגע שהנמטודות מוכנות לסריקה, ודאו שהביקורות החיוביות והשליליות מניבות את הפנוטיפים הצפויים. לאחר מכן, בחנו את בעלי החיים בניסוי לאיתור חריגות התפתחותיות.

בשלב הבא, באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה, הניחו שמונה עד 12 בעלי חיים מכל באר על גבי slides מסוג 4%Agri PET עם טיפה של 5 µL של חומר הרדמה. לאחר הנחת זכוכית כיסוי מתאימה, בצעו תצפיות בלפחות חמישה בעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ פתוח (compound microscopy). תחזיקו מאגר נתונים מאורגן של הגן, מספר בעלי החיים שנצפו והתוצאות הפנוטיפיות.

עבור כל ניסוי RNAi, יש לאמת כל פנוטיפ שהופק על ידי RNAi באמצעות פנוטיפ משני אחר במידת האפשר, ועל ידי חזרה על הניסוי; בניסויים חוזרים ניתן להשתמש בחיידקים מאותו פס (streak). פסים ישנים עלולים להוביל לצמיחה דלה בתרביות נוזליות למשך הלילה, ובמקרים אלו יש לבצע זריעה מחדש תחילה. חלק מהתרביות החיידקיות לא יגדלו היטב בשל מוצר הגן המבטא בפלסמיד שלהן.

במקרה זה, פשוט רכז את החיידקים לפני הזריעה. עבור סריקה מתמשכת, חשוב להחזיק תמיד מספר רב של עוברים מוכנים לשלב הדירוג (staging). יש להזין את זן הסריקה באופן קבוע, לא להרעיבו, ולוודא שהוא נקי מזיהומים שעלולים להשפיע על הפנוטיפ הנבדק.

קבענו לוח זמנים לתחזוקה עבור האכלת בעלי החיים. גנים המשפיעים על מיקום DBL one זוהו באמצעות RNAi תוך שימוש במאבד שתוכנן למסך זה. ביטוי נורמלי של תג GFP dbl one כולל גופי תאים בחבל העצבים הגבי (ventral nerve cord), ושורה של נקודות (puncti) בבעלי חיים שהוזנו ב-RA אנטי-סנס ל-DBL.

mRNA אחד הראה ביטוי מופחת מאוד של DBL one. בעלי חיים אלו היו קטנים, בדומה לבעלי חיים שחסר בהם DBL L one תפקודי. סקר ה-RNA I זיהה בהצלחה גנים רבים אחרים שמוצריהם משפיעים על מיקום ה-DBL one, ובכך הרחיב את הבנתנו לגבי אופן התנועה התת-תאית של TGF beta וסיפק נקודת מוצא למחקרי המשך רבים יותר.

בשימוש בשיטה זו, אדם אחד יכול להכין ולעקוב באופן סביר אחרי שתי עד ארבע סדרות של ניסויים בכל שבוע. לדוגמה, בעלי חיים שהוכנו ביום שני וביום שלישי ניתן לעקוב אחריהם ביום חמישי וביום שישי בהתאמה, וניתן להכין שוב בעלי חיים ביום שישי ובשבת עבור יום שני ויום שלישי. תצפית בעת ביצוע נוהל זה לאורך הסריקה שלכם.

חשוב להחזיק מספר רב של עוברים מוכנים לשלב התבייתות, ולכן יש לתחזק את זן הסריקה באופן קבוע. כמו כן, חשוב לרשום הערות מפורטות על כל התצפיות.