وفي اشارة الى نقص الأوكسجين داخل تعقب المجاميع خلية مغلف

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة الاستجابة الخلوية لنقص الأكسجة في مجاميع الخلايا المغلفة ب PEG. في الخطوة الأولى ، تصاب الخلايا المتناثرة بفيروس العلامة ثم يتم زراعتها على شاكر للسماح بتكوين الركام. يتم تشغيل الوتد الخطي التالي ويتم تنقية حافة PEG DM.

ثم يتم تغليف مجاميع الخلايا في هيدروجيل PEG DM. أخيرا ، يتم زراعة الهلاميات المائية في ظروف أكسجين مختلفة أثناء مراقبتها بالفلورسنت بحثا عن إشارة علامة نقص الأكسجة. في النهاية ، يمكن تصور موقع ومدى نشاط العامل المحفز لنقص الأكسجة داخل مجاميع مغلفة قابلة للحياة من الخلايا من خلال الفحص المجهري الفلوري البسيط.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تغليف الخلايا ومجالات التوصيل العلاجي القائم على الخلايا مثل أين يحدث نقص الأكسجة داخل الثقافات ثلاثية الأبعاد ، وكيف يؤثر على بقاء الخلية ووظيفتها؟ تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو مناهج الطب التجديدي وعلاج نقص الهرمونات مثل مرض السكري بسبب التأثير الرئيسي لنقص الأكسجة في الأنسجة المجمعة والمغلفة. ثبت أن نشاط العامل الأول المحفز لنقص الأكسجة يرتبط بانخفاض كبير في إفراز الأنسولين من خلايا بيتا ، مما يحفز محاولات فصل الثقوب الأولية وإصلاحها إلى ثقب زائف.

مجاميع من انخفاض القطر. يمكن أن تشير علامتنا إلى نشاط العامل المحفز لنقص الأكسجة مع مجاميع على المستوى الخلوي داخل أي مادة مغلفة مفككة. تم اختيار PEG كمادة كبسولة نظرا لخصائص النقل المواتية ، وتوافق cyto ، والسهولة التي يمكن بها تعديلها وظيفيا.

بعد وزن جرامين من PEG في قارورة زجاجية سعة 40 مليلتر بحوالي 308 ميكرولتر من الميثامفيتامين والأكريليك والأنهيدريد وأغلق القارورة بغطاء بلاستيكي صلب. ضع القارورة في الميكروويف على حرارة عالية لمدة دقيقتين في ميكروويف منزلي قياسي. ثم ارتداء قفازات مقاومة للحرارة ، قم بدوامة القارورة جيدا وتسخين المحلول في الميكروويف لمدة خمس دقائق إضافية.

اترك القارورة لفترة وجيزة لتبرد بدرجة كافية للتعامل معها ثم قم بفك غطاءها أثناء تدوير القارورة. اخلطي كلوريد الميثيلين ببطء ، وقم بتدوير العينة حسب الحاجة حتى يبدو المحلول واضحا ومتجانسة. بعد ذلك ، أضف المحلول بالتنقيط إلى 200 مل من الأثير الداثيل البارد المخفوق لترسيب PEG dm.

ثم اجمع PEG DM عن طريق الترشيح الفراغي واتركه حتى يجف. بمجرد أن يجف PEG DM ، قم بإذابته في حوالي 100 إلى 150 مل من الماء منزوع الأيونات. ثم غسيل الكلى للمحلول ضد الماء منزوع الأيونات لمدة خمسة أيام في أنابيب غسيل الكلى مع قطع الوزن الجزيئي 1000 دالتون بعد غسيل الكلى.

بليغ المحلول في حاويات مناسبة وتجميدها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر بين عشية وضحاها. ثم قم بتجميد المحلول لمدة أربعة أيام لتوليد مسحوق PEG DM أبيض منقى لتحرير الخلايا من سطح قارورة الثقافة المعالجة. أولا ، استنشق الوسط ، واشطف الخلايا ب 37 درجة CELs الكالسيوم ، و HBSS الخالي من المغنيسيوم ، وشفط HBSS.

أضف الآن ملليلترين من 37 درجة مئوية ومحلول EDTA ، واسمح للخلايا بالتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. ثم قم بتثبيت جانب القارورة بإحكام لتحرير الخلايا عند ثمانية ملليلتر من 37 درجة مئوية ، متوسطة إلى القارورة وقم بسحب تعليق الخلية بقوة لأعلى ولأسفل. الحرص على عدم إدخال الفقاعات.

بعد نقل محلول الخلية إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مليلتر ، قم بحساب الخلايا بواسطة مقياس الخلوي الدموي لتحديد العدد الإجمالي للخلايا المصابة. أضف الحجم اللازم لتعليق الخلية لتحقيق 400،000 خلية لكل بئر في آبار لوحة ثقافة معلقة بستة آبار 50 ميكرولترا من HBSS لكل بئر من الخلايا المراد إصابتها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.8 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بعمل ماصة بعناية الكمية المناسبة من تعليق الفيروس في HBSS المحضر.

أضف الآن الحجم المناسب من الفيروس المخفف إلى كل بئر لتحقيق سبل التنفيذ المطلوبة ، ثم أضف وسيطا إلى كل بئر ليصل الحجم الإجمالي إلى 1.7 ملليلتر. أخيرا ، ضع اللوحة على شاكر مداري داخل الحاضنة ، اضبط شاكر على إعداد منخفض حوالي 100 دورة في الدقيقة بحيث يغسل الوسيط برفق حول البئر ويسمح للخلايا بالتجمع لمدة 24 إلى 36 ساعة. ابدأ بقطع الطرف المدبب من حقنة بلاستيكية سعة ملليلتر واحد ووضعها مفتوحا في نهاية المطاف في رف لإنشاء وعاء سيتم فيه تشكيل الهيدروجيل.

بعد ذلك، ضع الماصة 20 ميكرولترا من محلول PEG DM النشط ضوئيا في الطرف المفتوح للحقنة على المكبس، مع التأكد من أن الحجم يغطي سطح المكبس بالكامل. اضبط المكبس بزيادات صغيرة لتحقيق سطح سائل مستو. الآن ضع الماصة مرة أخرى في الحامل وضع الحامل أسفل مصباح الأشعة فوق البنفسجية لمدة ثماني دقائق تقريبا للسماح بالربط المتقاطع بالهيدروجيل.

خلال هذا الوقت، يحتوي حجم الماصة على العدد المطلوب من الخلايا والتجميعات في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.8 ملليلتر. قم بتغطية الأنبوب ثم طرد الخلايا والركام لمدة خمس دقائق عند 130 جراما. ثم باستخدام ماصة صغيرة ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية عند طرف الأنبوب.

عندما يقترب رأس الوسائط من الحبيبات ، استخدم طرف ماصة أدق سعة 10 ميكرولتر لتشتيت مجاميع الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء محلول سلائف الهلام مع التأكد من تغليفها بالكامل. إنه أصعب جزء في هذا الإجراء. عند تنفيذ هذه الخطوة ، احرص على إعادة الحبيبات ونقلها برفق.

الآن ، قم بإعادة تعليق حبيبات الخلية برفق في 20 ميكرولتر من محلول PEG DM النشط للصور. باستخدام طرف ماصة واسع الفم وأضف تعليق الخلية إلى المحقنة أعلى جزء الهيدروجيل المتشابك ، قم بتعريض المحقنة لمدة ثماني دقائق إضافية من ضوء الأشعة فوق البنفسجية لإكمال بناء الهيدروجيل. عند الانتهاء ، يجب تغليف الخلايا بالكامل داخل الهيدروجيل الأسطواني.

أخيرا ، أضف ملليلتر واحد من HBSS في بئر واحد من صفيحة 24 بئر ومليلتر واحد من الوسائط إلى آخر. حسنا ، ثم قم بإخراج الهيدروجيل من المحقنة في HBSS لغسل الجل لفترة وجيزة. انقل الجل إلى الوسائط وقم بزراعة اللوحة في ظل الظروف المرغوبة.

في أي وقت أثناء الثقافة ، يمكن تصوير الخلايا باستخدام المجهر الفلوري لتتبع بدء مكان الإشارات الناقصة للأكسجين ، لوحة 24 بئر على مرحلة المجهر ، مع توسيط البئر مع الهيدروجيل تحت الهدف. الإشارة محددة بما يكفي لتحديد خلايا الإشارات الفردية ، ولكن قد تكون الدقة غير كافية لتحديد توطين الإشارة داخل الخلايا. في خلايا الإشارات ، عادة ما تتم ملاحظة الإشارة بشكل موحد في جميع أنحاء السيتوبلازم.

يوضح هذا الشكل مثالا تمثيليا لمجاميع Minx المغلفة في هيدروجيل PEG داخل خلية الهلام. يجب أن تكون الركام محاطة بالكامل بالمصفوفة وتوزيعها بشكل متجانس للسماح بنقل المغذيات بشكل أفضل كما هو موضح هنا. لاحظ كيف أن هلام الوصلة المتقاطعة صلب طوال الوقت ويأخذ شكل الوعاء الذي تم فيه إجراء التفاعل.

في هذا الشكل ، يظهر نقص الأكسجة الفلوري الممثل في ست خلايا مجمعة على الأقل في هيدروجيل PEG DM الخلايا التي تم تغليفها ثم وضعها في حضانة بنسبة 20٪ من الأكسجين لمدة 44 ساعة. في الصورة على اليسار لا تظهر إشارات نقص الأكسجة بينما الخلايا التي تم تغليفها ثم تحضنها في 2٪ أكسجين لمدة 44 ساعة. كما هو موضح في الشاشة اليمنى ، يمكن أيضا تتبع نقص الأكسجة الواضح في كل مكان في أنواع الخلايا الأخرى.

يوضح هذا الشكل إشارات تمثيلية لنقص التأكسج في مجاميع الخلايا الجذعية الوسيطة المغلفة. كما هو موضح في الشكل الموجود في أقصى اليسار ، لا يمكن اكتشاف إشارة الفلورسنت في 12 ساعة في 2٪ أكسجين ، ثم كما هو موضح في الشكل المركزي يكون أكثر وضوحا بعد 24 ساعة و 2٪ أكسجين. وأخيرا ، كما هو موضح على اليمين يتم التعبير عنه بشكل كبير بعد 96 ساعة و 2٪ أكسجين بعد هذا الإجراء.

إجراء طرق أخرى مثل Eliza وتحليل البروتينات المفرزة ومقايسات صلاحية الخلية من أجل ربط إشارات نقص الأكسجين بالنمط الظاهري للخلية. مع هذا التطور ، يمكن لهذه التقنية أن تمهد الطريق للباحثين في مجالات هندسة الأنسجة والتوصيل العلاجي القائم على الخلايا لاستكشاف وظيفة البقاء على قيد الحياة وتمايز الخلايا داخل السقالات ومواد التغليف.