تحديد نشاط أكلة العينات السريرية جسم

الهدف من التجربة التالية هو تحديد النشاط البلعمي للأجسام المضادة الخاصة بالمستضد في العينات السريرية ذات الإنتاجية العالية. يتم تحقيق ذلك من خلال طلاء حبات الفلورسنت أولا بمستضد مفضل للسماح بالتقاط الجزء الخاص بالمستضد من الجسم المضاد الموجود في عينات الأجسام المضادة السريرية المعقدة. كخطوة ثانية للبلعمة ، يتم تحضين خلايا TP one مع حبات الفلورسنت المتأينة ، والتي ثم البلعمة الخرزات مدفوعة بالعدد وخصائص مجال FC للأجسام المضادة المرتبطة.

بعد ذلك ، يتم تحديد شدة التألق لخلية THP الواحدة عن طريق قياس التدفق الخلوي القائم على اللوحة عالي الإنتاجية من أجل تحديد النشاط البلعمي للأجسام المضادة الموجودة في العينة. في النهاية ، يمكن تقييم قدرة الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد في العينة على إحداث البلعمة بناء على الامتصاص التفاضلي للحبات الفلورية المرجعية بسبب عيار الأجسام المضادة المتغير أو التعرف المتغير بواسطة مستقبلات الأجسام المضادة المعبر عنها على الخلايا البلعمة. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تلك التي تستخدم الخلايا البلعمية الأولية في زيادة الإنتاجية وتحسين التوحيد القياسي.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول المناعة الأساسية للاستجابة المناعية التكيفية ، مثل ما إذا كانت أنظمة اللقاح المختلفة ، مستحثة على الأجسام المضادة ذات الأنشطة المختلفة. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج الأمراض المعدية لأن الأجسام المضادة تساهم بشكل كبير في تكوين استجابة مناعية وقائية فعالة. على الرغم من أننا استخدمنا هذه الطريقة لتقديم نظرة ثاقبة لنشاط الأجسام المضادة في الإصابة التدريجية بفيروس نقص المناعة البشرية والتطعيم ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على حالات مرضية أخرى مثل الأنفلونزا والمناعة الذاتية وحمى الضنك ، حيث يمكن للأجسام المضادة frago أن تؤدي إلى تفاقم مرض D بدلا من توفير الحماية.

ابدأ بتخفيف المستضد في مخزن مؤقت لا يحتوي على الأمينات الأولية. ثم قم بإذابة السلفا NHS lc ، كاشف البيوتين في الماء. بعد ذلك ، أضف الكاشف المطفأ على الفور إلى المستضد واترك التفاعل يستمر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أثناء الخلط.

من حين لآخر عند اكتمال التفاعل ، أضف العينة إلى الغرفة العلوية لوحدة تركيز الطرد المركزي لإزالة أي بيوتين زائد غير مترافق عن طريق التبادل العازل. أضف الآن PBS لرفع الحجم الإجمالي إلى خط تعبئة 15 ملليلترا. أخيرا ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 4 ، 000 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية حتى ينخفض الحجم إلى حوالي 1.5 ملليلتر.

كرر هذه الخطوة ثلاث مرات لتحقيق الإزالة الكمية تقريبا للبيوتين الحر. بعد تدوير 100 ميكرولتر من حبات eut tradin الفلورية الدقيقة في جهاز طرد مركزي دقيق عند 13 ، 000 مرة G لمدة خمس دقائق ، قم بإعادة تعليق وغسل الخرزات في مليلتر واحد من 0.1٪ P-B-S-B-S-A باتباع نفس إجراء الطرد المركزي. ثم بعد تعليق Resus للحبات المغسولة في 100 ميكرولتر من P-B-S-B-S-A ، مرة أخرى ، قم بتقطيع الخرزات مرة أخرى إلى 10 أنابيب صغيرة من التدخين.

بعد ذلك ، امزج 10 ميكرولترات من معلق الخرزة المغسول بتركيزات متفاوتة من مستضد البيوتينيل في خطوات قابلة للطي. ثم احتضان معلقات الخرزة والمستضد طوال الليل عند أربع درجات مئوية في أنبوب طرد مركزي دقيق على مدور. في اليوم التالي.

قم بإزالة أي مستضد غير مرتبط عن طريق غسل المعلقات مرتين بمليلتر واحد من P-B-S-B-S-A وقم بطرد العينات بسرعة عالية كما كان من قبل حتى يتم تكوير الخرز. أخيرا ، يقوم ريس بتعليق الخرز المطلي بالمستضد في حجم نهائي يبلغ ملليلتر واحد من P-B-S-B-S-A بعد تنقية عينات الأجسام المضادة السريرية من البلازما باستخدام مجموعة تنقية IgG من هلام البطيخ. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، حدد تركيز الأجسام المضادة المنقاة عن طريق الامتصاص عند 80.

ثم قم بتخفيف الأجسام المضادة إلى مليغرام واحد لكل مليلتر في PBS ، مع وضع عينات جانبا للأجسام المضادة أحادية النسيلة الإيجابية والسالبة أيضا. بعد ذلك ، قم بتعليق محلول الخرزة المشبعة بالمستضد عن طريق الدوامة ثم انقل 10 ميكرولترات من المحلول إلى كل بئر من لوحة بئر مستديرة القاع 96 ، احرص على تحريك تعليق الخرزة باستمرار لضمان إضافة أعداد متساوية من حبات الفلورسنت إلى كل بئر. قم بإنشاء منحنى استجابة جرعة لكل جسم مضاد للتحكم عن طريق إضافة تركيزات متفاوتة من الأجسام المضادة ذات الأهمية بأحجام لا تزيد عن 20 ميكرولترا لكل منها.

حسنا ، احتضان عينات الخرزة والأجسام المضادة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية للسماح للأجسام المضادة بالارتباط بالخرز قبل الانتهاء مباشرة من الخرز. يحضن يخفف عينة من THP خلية واحدة بمعدل 2.5 في 10 إلى الخلايا الخمس لكل مليلتر في الوسائط. ثم أضف 200 ميكرولتر من الخلايا إلى كل منها.

حسنا ، أخيرا ، احتضان الخلايا بالخرز المطلي بالأجسام المضادة طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة ثابتة ، مما يسمح للخلايا والخرز بالاستقرار عن طريق الجاذبية. في اليوم التالي ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من سوبينات من كل بئر مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات الخلية. قم بإصلاح الخلايا في 100 من 4٪ من الفورمالديهايد ، ثم قم بتثبيت الماصة لإعادة تعليق الخلايا وخلطها.

الآن قم بتحميل اللوحة على قارئ لوحة HTS لمقياس التدفق الخلوي عالي الإنتاجية ، مما يسمح بجمع البيانات آليا. يتم التقاط شدة التألق لخلية HTHP الواحدة وتسجيلها. ثم يتم استخدام شدة التألق هذه لتحديد عدد البلعمة من قبل كل خلية ، والتي تحدد نشاط البلعمة لعينة الجسم المضاد التي يتم اختبارها.

يجب أن يكون هناك تمايز واضح بين عينات الأجسام المضادة من الأشخاص المصابين وغير المتأثرين. في هذا الشكل. يوضح الرسم البياني للحقائق لعينة من الجسم المضاد من موضوع سلبي لفيروس نقص المناعة البشرية يمثله Black Trace وموضوع إيجابي لفيروس نقص المناعة البشرية يمثله الأثر الرمادي ، زيادة البلعمة الناجمة عن وجود أجسام مضادة خاصة بالمستضد.

الحساسية المثلى لهذا الاختبار على تشبع الخرز بمستضد البيوتينيل كما هو موضح هنا. تم تحديد مستضد ميكروغرامين لكل ميكرولتر من الخرز ليكون التركيز المشبع لهذا المستضد. يوضح منحنى استجابة الجرعة هذا القدرة التفاضلية لعينات الأجسام المضادة الموضوعة للحث على البلعمة على نطاق تركيز الأجسام المضادة من 0.05 إلى خمسة ميكروغرام لكل مليلتر.

قد يكون هذا البلعمة التفاضلية مدفوعا إما بالاختلافات في العيار أو في خصائص مجال FC مثل الفئة الفرعية IgG أو حالة الارتباط بالجليكوزيل. عندما يتم تصوير خلايا TP واحدة بواسطة الفحص المجهري الفلوري ، هناك دليل واضح على البلعمة الخرزية. توضح هذه الصورة الثابتة لخلايا TP واحدة بعد الحضانة مع حبات الأجسام المضادة في الخرز الأخضر وغير الاختياري باللون الأحمر عدم امتصاص البلعمة في غياب الجسم المضاد حيث كانت الخرزات الخضراء فقط هي الخلايا التي تم إجراؤها بواسطة خلايا TP واحدة.

عند إجراء الفحص المجهري بفاصل زمني ، يكون امتصاص البلعمة الخاص بالأجسام المضادة للحبات الفلورية أكثر لفتا للنظر. حبات الفلورسنت الخضراء التي تظهر هنا متأينة بالأجسام المضادة. توفر حبات الفلورسنت الحمراء التحكم السلبي بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء اختبارات أخرى لوظيفة الجسم المضاد من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول خصائص استجابة الجسم المضاد للعدوى أو التطعيم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد النشاط البلعمي لعينات الأجسام المضادة باستخدام قياس تدفق التدفق الخلوي للعين. لا تنس أن العمل مع عينات الدم والبلازما السريرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأن الاحتياطات مثل ارتداء الحماية الشخصية المناسبة واتباع إجراءات التعامل الآمن يجب دائما اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.